Détection des réponses physiologiques des neurones sensoriels chez la drosophile

1. Préparation des échantillons

1. Traversez la ligne de conduite Gal4 jusqu’aux mouches UAS-GCaMP5G Drosophila melanogaster (w ; P{20XUAS-IVS-GCaMP5G}attP40). Laisser pousser le croisement à 25 °C
   note: Générer des mouches avec plusieurs copies des transgènes Gal4 ou UAS-GCaMP peut aider à augmenter l’intensité du signal fluorescent. Une version antérieure du transgène UAS-GCaMP (UAS-GCaMP3) présentait une très faible intensité de fluorescence lorsqu’elle était exprimée sous le contrôle du pilote Gr68a-Gal4.
   1. Recueillir et séparer par sexe les mouches adultes nouvellement fermées et les élever à 25 °C
      REMARQUE : Le niveau de base de fluorescence de GCaMP5G est optimal chez les mouches âgées de 14 à 28 jours. L’isolement des mouches par sexe exclut la possibilité d’interactions sociales qui pourraient influencer les réponses neuronales.
2. Anesthésie une mouche sous un léger jet de CO₂.
3. Fixez la braguette à une lamelle en verre en plaçant d’abord une petite goutte de vernis à ongles au centre d’une lamelle de 0,17 mm. Placez délicatement une mouche sur le côté sur la goutte de vernis à ongles transparent et assurez-vous que la mouche recouvre toute la goutte.
4. Effectuez les étapes 1.5 et 1.6 sous un stéréomicroscope de dissection, utilisé à un grossissement de 8X.
5. Utilisez un pinceau humide pour étendre la patte avant de la mouche. Fixez la patte avant en position en plaçant deux fines bandes de ruban adhésif sur les premier et cinquième segments tarsiens (Figure 1A). Cela exposera les segments tarsiens T2-T4 pour l’imagerie (Figure 1B).
6. Pour imager les neurones sur la trompe, placez une fine bande de ruban adhésif sur le rostre de la trompe pour exposer le labelle (figures 1C, D).
7. Dessinez une barrière hydrophobe autour de la mouche avec un stylo PAP (Peroxydase-antiperoxydase) pour empêcher la solution de s’écouler sur la surface de la lamelle. Mesurez dans les 30 minutes suivant le montage.

2. Préparation de la solution de stimulus

1. Ligands lipophiles dilués (tels que CH₅0₃, utilisé dans cette étude) dans une solution de PBST (solution saline tamponnée au phosphate avec Triton X-100) : 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, 0,1 % Triton X-100 (v/v) ; pH 7,4.
   1. Préparez une solution mère de 1 mg/ml du ligand à l’aide de PBST. Préparez toutes les dilutions ultérieures de la solution mère à l’aide de PBST.
      note: En fonction de la solubilité du ligand d’intérêt, différents solvants peuvent être nécessaires pour le dissoudre. Le tableau 1 décrit la solubilité du CH₅, 0,₃ dans divers solvants. Contrairement à d’autres solvants, le PBST n’a pas augmenté la fluorescence.

3. Stimulation des neurones gustatifs et acquisition d’images

1. À l’aide d’une pipette de 10 μl, placez 10 μl de PBST sur les segments tarsiens.
   note: Cette étape humidifie la jambe et empêche les segments tarsiens de dériver.
2. Utilisez un système optique doté d’une caméra d’une vitesse et d’une sensibilité suffisantes pour obtenir un bon signal de fluorescence à haute résolution temporelle.
   note: Pour cette étude, nous avons utilisé un microscope confocal à disque rotatif et une caméra sCMOS (voir Liste des matériaux).
3. Choisissez le segment de tarse et les neurones spécifiques à imager. Acquérez trois piles Z confocales de pré-stimulation.
   1. Idéalement, utilisez des paramètres d’acquisition suffisamment rapides pour permettre une résolution temporelle maximale tout en capturant l’intégralité du volume de la cellule. Exemples de paramètres d’acquisition : exposition de 200 ms, binning de 2 x 2 et 6 sections optiques de 0,5 μm2, capturées toutes les 2 s.
      REMARQUE : Les jambes immobilisées ont été imagées avec succès jusqu’à 10 min, à des intervalles de 30 secondes, sans blanchiment perceptible du signal GCaMP. Pour des durées d’enregistrement plus longues, assurez-vous que les pieds sont bien maintenus en place sur la lamelle.
   2. Optimisez la puissance laser pour obtenir le rapport signal/bruit le plus élevé possible avec un photoblanchiment minimal pendant toute la durée du régime d’imagerie. Pour les expériences décrites ici, utilisez un laser à diode de 491 nm (100 mW) à 30 % de transmission pour imager les neurones gustatifs Gr68a et ppk23 sur les jambes et le proboscis. Utilisez le binning 2 x 2 pour permettre des temps d’exposition plus courts tout en obtenant une résolution spatiale suffisante.
      note: Les paramètres de puissance du laser ont été optimisés pour détecter les changements fluorescents allant d’une augmentation de 1,2 à 4,5 fois.
4. Pipeter 10 μl de la solution de stimulus sur les segments tarsiens. Ajouter 10 μl supplémentaires de PBST pour les expériences de contrôle. Acquérez immédiatement 117 images post-stimulation.
   note: Le nombre d’images de post-stimulation acquises est basé sur le temps qu’il a fallu pour atteindre le changement maximal de fluorescence (environ 2 min).
   1. ÉTAPE CRITIQUE : Lors du pipetage de la solution sur la préparation, ne touchez pas la mouche avec la pointe de la pipette, car cela ferait bouger la patte avant hors de sa position.
      note: Alternativement, à l’aide d’un micromanipulateur, positionner avec précision un capillaire en verre contenant un stimulus près du segment tarsien à imager. Administrer des volumes contrôlés de stimulus à l'aide d'un distributeur de micro-injection intracellulaire selon les instructions du fabricant.

Figure 1 : Montage d’une mouche vivante pour l’imagerie des neurones de la patte antérieure ou du proboscis. (A) Montage de la patte antérieure : une image 3,2X d’une mouche mâle vivante, montrant les pattes antérieures fixées à la lamelle avec du ruban adhésif. (B) Une image 40X de la mouche montre chacun des segments tarsiens (T1-5) et l’emplacement du ruban au-dessus du premier segment tarsien et sur le cinquième segment tarsien. (C) Montage de la trompe : un morceau de ruban adhésif est placé sur le rostre pour exposer l’extrémité de la trompe. (D) La pointe de la pipette pour l’ajout de stimulus est tenue légèrement au-dessus de la mouche et n’entre pas en contact direct avec la préparation.

Tableau 1 : Solubilité de CH503 dans divers solvants. DMSO : Diméthylsulfoxyde. Des solutions d’éthanol, d’hexane et de DMSO ont été diluées avec du dH2O (v/v). La solubilité du CH503 dans le DMSO à 0,2 % n’était limitée qu’à 250 ng/ml. L’augmentation de ΔF/F avec le solvant seul était équivalente à celle observée lors de la stimulation avec des phéromones.