Stimulation optogénétique et enregistrement électrophysiologique d’événements synaptiques dans des coupes de cerveau de rat

Résumé

Source : Kinnavane, L., et al. Interrogation optogénétique ex vivo de la transmission synaptique à longue distance et de la plasticité du cortex préfrontal médial au cortex entorhinal latéral. J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo montre la procédure d’étude de l’efficacité synaptique dans le cortex entorhinal latéral (LEC) en stimulant optogénétiquement les axones du cortex préfrontal médian (mPFC) et en enregistrant les réponses des neurones pyramidaux dans le LEC. Cette méthode combine des enregistrements par patch-clamp avec l’activation synaptique par stimulation lumineuse pour étudier la plasticité synaptique.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Électrophysiologie et stimulation optogénétique

1. Identification de la cellule cible.
   1. Placer la tranche dans une chambre d’enregistrement immergée à 34 °C perfusée avec du liquide céphalorachidien artificiel (LCR-A) à un débit de 2 mL/min à l’aide d’une pompe péristaltique. Immobilisez la tranche à l’aide d’un ancrage de tranche.
   2. Sous l’objectif à faible grossissement (4x) d’un microscope à grand champ utilisant un éclairage infrarouge oblique, naviguez jusqu’à la couche 5 du cortex entorhinal latéral (LEC). Mesurez la distance entre la surface du pilier et la couche requise.
      note: L’éclairage infrarouge oblique a été obtenu en positionnant une LED proche infrarouge à environ 3 mm au-dessous de la lamelle de la chambre d’enregistrement, à un angle de ~55° par rapport au plan de la lamelle (figure 1B). Le contraste interférentiel différentiel est une technique d’imagerie alternative et couramment utilisée pour l’électrophysiologie en tranches.
   3. Passez à un objectif d’immersion dans l’eau à fort grossissement (40x) et identifiez les neurones pyramidaux. Marquez la position de la cellule sur l’écran de l’ordinateur avec tape.
      note: Les neurones pyramidaux ont une morphologie grossièrement triangulaire avec des dendrites apicales proéminentes projetées vers la surface piale de la tranche (Figure 2A). La santé cellulaire peut être évaluée par l’absence d’un noyau condensé et visible et l’inspection de la membrane plasmique qui doit apparaître lisse. Il est peu probable qu’un marquage fluorescent clair des axones par la protéine de fusion opsine-fluorophore soit visible lors de l’utilisation d’un microscope à fluorescence à grand champ. Pour visualiser les projections axonales, effectuez une immunohistochimie post-hoc à l'aide d'un anticorps primaire contre le fluorophore de l'opsine et amplifiez avec un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore de même longueur d'onde ou de longueur d'onde similaire.
2. Formation d’une pince patch à cellules entières.​
   1. Fabriquer une micropipette en verre borosilicaté à l'aide d'un extracteur de pipette et la remplir d'une solution d'enregistrement intracellulaire filtrée (120 mM de k-gluconate, 40 mM de HEPES (acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-éthanesulfonique), 10 mM de KCl (chlorure de potassium), 2 mM de NaCl (chlorure de sodium), 2 mM de MgATP (adénosine triphosphate de magnésium), 1 mM de MgCl (chlorure de magnésium), 0,3 mM de NaGTP (guanosine triphosphate de sodium), 0,2 mM d'EGTA (acide tétraacétique d'éthylène glycol), et 0,25 % de biocytine fabriquée dans de l’eau ultrapure (UPW), pH 7,25, 285-300 mOsm). Placez la micropipette remplie dans le porte-électrode sur la tête de l’amplificateur patch-clamp, en vous assurant que le fil de l’électrode est en contact avec la solution intracellulaire.
   2. Appliquez une pression positive par la bouche en soufflant fort dans un embout buccal (comme une seringue de 1 mL avec le piston retiré) relié par un tube à l’orifice latéral du porte-électrode et maintenez la pression en fermant une valve à trois voies en ligne. Soulevez l’objectif du microscope de manière à ce qu’un ménisque se forme et insérez l’électrode dans le ménisque jusqu’à ce qu’elle soit visible au microscope.
   3. Ouvrez la fenêtre de test d’étanchéité dans WinLTP16 (ou un autre logiciel d’acquisition/oscilloscope) et, avec l’amplificateur en mode pince de tension, appliquez une impulsion carrée de 5 mV pour déterminer si la résistance de la pipette est de 3 à 6 MΩ.
   4. Approchez-vous de la cellule identifiée et touchez-la avec la pointe de la pipette, ce qui devrait entraîner une indentation dans la membrane cellulaire (Figure 2A ; panneau de droite) et une légère augmentation de la résistance de la pipette (0,1 MΩ).
   5. Relâchez la pression positive et appliquez une pression négative en appliquant une aspiration modérée au niveau de l’embout buccal, ce qui devrait entraîner une augmentation considérable de la résistance de la pipette (>1000 MΩ). La pression peut maintenant rester neutre. Appliquez une pression négative dans une rampe augmentant progressivement jusqu’à ce que la membrane cellulaire se rompe, ce qui entraîne des transitoires de capacité de la cellule entière.
3. Enregistrer les événements synaptiques évoqués optogénétiquement.
   1. Entrez current-clamp configuration.
      REMARQUE : Dans la plupart des cas, la transmission synaptique à longue portée est glutamatergique, donc l’enregistrement à des potentiels membranaires proches du potentiel d’inversion du chlorure permettra d’isoler au mieux la transmission médiée par le récepteur AMPA (AMPAR) et de minimiser la mesure de toute inhibition par anticipation (FFI) évoquée. L’inversion du chlorure dépend de la composition de la solution d’enregistrement intracellulaire et de l’aCSF et peut être calculée à l’aide de l’équation de Goldman-Hodgkin-Katz ; pour les solutions ci-dessus, il s’agissait de -61,3 mV. Les neurones pyramidaux LEC de couche 5 avaient un potentiel membranaire moyen au repos de -62 mV et, le cas échéant, étaient maintenus à ce potentiel par injection de courant constant. Alternativement, les cellules peuvent être limitées en tension au potentiel souhaité. Pour enregistrer des projections inhibitrices à longue portée16 ou pour enregistrer FFI, une tension clamp au potentiel d’inversion cationique pour isoler la conductance du chlorure GABAergique. Lorsque des neurones de tension clampent à des potentiels membranaires supérieurs au seuil de potentiel d’action, une solution intracellulaire à base de césium contenant des inhibiteurs des canaux sodiques voltage-dépendants est utilisée pour améliorer le voltage-clamp et empêcher l’initiation des potentiels d’action (130 mM CsMeSO4 (méthanesulfonate de césium), 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 5 mM de chlorure QX 314, 4 mM de MgATP, 0,5 mM d’EGTA, 0,3 mM de NaGTP, 0,25 % de biocytine fabriquée dans l’UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm).
   2. À l’aide d’un logiciel d’acquisition de données, envoyez des signaux TTL (Transistor-Transistor Logic) à un pilote de LED (diode électroluminescente) pour activer une LED 470 nm montée. La LED montée est dirigée dans le trajet lumineux du microscope à l’aide de cubes de filtre et d’optiques appropriées (Figure 1B) pour appliquer des impulsions lumineuses à la tranche via l’objectif 40x afin d’évoquer des potentiels post-synaptiques excitateurs optogénétiques (oEPSP).
      note: Des impulsions lumineuses peuvent être appliquées périsomatiquement/sur les dendrites, ce qui entraînera l’activation des opsines dans les axones et le bouton présynaptique, ou l’investigateur peut déplacer l’objectif vers les axones loin de la cellule enregistrée pour éviter une stimulation excessive du bouton. L’amplitude maximale de l’oEPSP dépend de l’intensité de la projection synaptique, de l’efficacité des injections virales et de l’opsine utilisée. oEPSP peut être titré à l’amplitude souhaitée en faisant varier l’intensité et/ou la durée de la lumière18 ; La variation de la durée des impulsions lumineuses (durée typique entre 0,2 et 5 ms à la puissance de sortie maximale de la LED, ce qui se traduit par une densité lumineuse de 4,4 mW/mm19) permet d’obtenir des amplitudes oEPSP plus constantes que la modification de la puissance de sortie de la LED.
   3. Étudier les propriétés de libération présynaptique (changement de tension) en délivrant des trains de plusieurs impulsions lumineuses avec des intervalles inter-stimulus différents (Figure 2E) ; des précautions doivent être prises lors de l’interprétation de la transmission évoquée optogénétiquement.
   4. Étudier la plasticité à long terme, soit en évoquant de manière répétitive des oEPSP19, soit en appliquant des ligands. Surveiller l’amplitude de l’oEPSP pendant 5 à 10 minutes pour assurer la stabilité avant l’induction de la plasticité, puis surveiller jusqu’à ce qu’une amplitude stable soit atteinte (généralement 30 à 40 min).
      note: La plupart des opsines actuelles ne sont pas capables d’évoquer de manière fiable plusieurs potentiels d’action à des fréquences élevées, par exemple, 100 stimuli délivrés à 100 Hz, comme c’est généralement le cas pour induire la LTP.
   5. Pour confirmer que les oEPSP sont monosynaptiques, effectuer l’activation par sur-bouton de la voie transduite en positionnant l’objectif sur l’arbre dendritique et en stimulant en présence de 0,5 μM de tétrodotoxine et de 100 μM d’aminopyridine. L’application de tétrodotoxine abolira la transmission si les réponses dépendent du potentiel d’action, et l’inclusion ultérieure d’aminopyridine rétablira partiellement la transmission si les oEPSP sont générés de manière monosynaptique19,20.
   6. Pour permettre à la biocytine de remplir le neurone, attendez au moins 15 minutes après être entré dans la configuration de la cellule entière. Dans la pince de tension, surveillez la capacité de la membrane et la résistance d’entrée.
   7. Retirez lentement la pipette le long de l’angle d’approche en s’éloignant du soma de la cellule, en observant la lente disparition des transitoires de capacité et du courant membranaire, indiquant la réétanchéité de la membrane cellulaire et la formation d’une tache extérieure à l’extrémité de la pipette. Notez l’orientation de la tranche et l’emplacement de la ou des cellules à l’intérieur de la tranche. Placez la tranche dans du PFA (paraformaldéhyde) dans une plaque à 24 puits, incubez une nuit à 4 °C, puis transférez à 0,1 M PB.
      note: Les tranches peuvent être conservées jusqu’à une semaine. Si un stockage plus long est nécessaire, changez régulièrement le PB (tampon phosphate) ou utilisez du PB contenant de l’azoture de sodium (0,02 % à 0,2 % d’azoture de sodium).

Résultats

Figure 1 : Chambre de collecte de coupes et configuration optique pour les enregistrements visualisés de cellules entières, l’excitation optogénétique et l’identification des neurones positifs à la tdTomato. (A) La chambre de collecte des tranches14 est fabriquée sur mesure à partir d’un support de tube de microcentrifugation collé sur une feuille de maille de nylon et placé d...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Vanne Luer 3 voies	Cole-Parmer	WZ-30600-02
Objectif 40x	Olympe	LUMPLFLN40XW
4-aminopyridine	Bonjour Bio	Réf. HB1073
4x objectif	Olympe	PLN4X/0.1
Lentille achromatique	Edmund Optics	Référence 49363	Focalise le spectre visuel et le proche infrarouge
Microcentrifugeuse de paillasse	Benchmark scientifique	Réf. C1005*
Biocytine	Sigma-Aldrich	Réf. B4261
Capillaire en verre borosilliqué	Warner Instruments	G150F-6
CaCl2	Sigma-Aldrich	Réf. C5670
Appareil photo - Qimaging Retiga Electro	Photométrie	01-ÉLECTRO-M-14-C
Carbachol	Tocris	Référence 2810
Gommage chirurgical à la chlorhexidine	Vetasept	Référence : XHG008
tondeuse	Andis	Référence 22445	Tondeuse à lame amovible AGC Super 2 vitesses
Lentille de condensateur de collimation	ThorLabs	ACL2520-A
Lamelles	Fisher Scientific Ltd	10011913
cryostat	Leica	CM3050 S
CsMeSO4	Sigma-Aldrich	Réf. C1426
Colle cyanoacrylate	Rapid Electronics Ltd	Référence 84-4557
Dispositif d’acquisition de données	National Instruments	USB-6341 BNC
D-glucose	Sigma-Aldrich	Référence G8270
Miroir dichroïque 500 nm passe-long	Edmund Optics	Référence 69899
Miroir dichroïque 600 nm passe-long	Edmund Optics	Référence 69901
Cube miroir dichroïque	ThorLabs	CM1-DCH/M
EGTA	Millpore	324626
Porte-électrode avec port latéral	HEKA	Référence 895150
Filtre d’émission	Chroma	59022m
Filtre d’excitation	Chroma	ET570/20x
Gel pour les yeux	Dechra	Lubrifiant
Pinceau fin	Fournitures de laboratoire scientifique	BRU2052
guillotine	Instruments de précision mondiaux	DCAP
HEPES	Sigma-Aldrich	N° H3375
Solution de peroxyde d’hydrogène	Sigma-Aldrich	N° H1009	30 % (p/p)
L’isoflurane	Henry Schein	Référence 988-3245
Isopentane	Sigma-Aldrich	Référence M32631
Kcl	Sigma-Aldrich	Réf. P3911
K-gluconate	Sigma-Aldrich	G4500
Cube de filtre à fluorescence cinématique	ThorLabs	DFM1T1
Pilote de LED	ThorLabs	LEDD1B
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187
MgCl	Sigma-Aldrich	M2670
Magnésium (MgSO4	Sigma-Aldrich	Référence M7506
Extracteur de microélectrodes	Instruments de sutter	P-87
Seringue de micro-injection	Hamilton	Référence 7634-01/00
Aiguille de seringue de micro-injection	Hamilton	Référence 7803-05	Spécification personnalisée : jauge 33, longueur 15 mm, style de pointe 4 - 12°
Pompe à seringue de micro-injection	Instruments de précision mondiaux	UMP3T-1
LED bleue montée	ThorLabs	M470L5
Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S9390
NaCl	Sigma-Aldrich	Réf. S9888
NaGTP	Sigma-Aldrich	Référence G8877
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	Réf. S0751
NaH2PO4.H2O	Sigma-Aldrich	Réf. S9638
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
LED NIR	OSRAM	SFH4550	Utilisée pour l’imagerie IR réfractée de tranches, l’optique à contraste interférentiel différentiel (DIC) est une autre méthode couramment utilisée
paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	158127
paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	Réf. P6148
Amplificateur patch clamp	Dispositifs moléculaires	700A
Pompe péristaltique	Instruments de précision mondiaux	Ministar
Lames de microscope recouvertes de poly-L-lysine	Fisher Scientific Ltd	Tél. : 23-769-310
Chambre d’enregistrement	Warner Instruments	RC-26G
Ancre de tranche	Warner Instruments	SHD-26-GH/15
Support stéréotaxique pour micro-foret	Appareil de Harvard	75 à 1874
saccharose	Sigma-Aldrich	S0389
Microscope chirurgical	Carl Zeiss	OPMI 1 FR pro
Filtre de seringue pour solution d’enregistrement intracellulaire	Thermo Scientific Nalgene	Référence 171-0020
Microscope à fluorescence droit	Leica	DM6 B
solution
LCRa
Solution de coupe du saccharose
PFA