Chargement et déchargement du colorant FM médié par des microélectrodes dans les cellules nerveuses des larves de drosophile

Résumé

Source : Kopke, D. L., et al., FM cycle du colorant au niveau de la synapse : comparaison de la dépolarisation élevée du potassium, de la stimulation électrique et de la canalrhodopsine. J. Vis. Exp. (2018)

Dans cette vidéo, les fibres nerveuses des larves de drosophile sont immergées dans un colorant FM, qui se lie aux lipides de la membrane cellulaire. La microélectrode d’aspiration et les impulsions électriques stimulent le processus d’endocytose, incorporant le colorant FM dans les vésicules endocytaires nouvellement formées. Cette méthode, qui permet de visualiser les stades présynaptiques de la neurotransmission, est utile pour étudier la fonction synaptique et la libération de neurotransmetteurs.

Protocole

1. Dissection de la colle larvaire

1. Mélangez soigneusement 10 parties de base en élastomère de silicone avec 1 partie d’agent de durcissement en élastomère de silicone du kit élastomère.
2. Enduire d’élastomère des lamelles en verre de 22 x 22 mm et durcir sur une plaque chauffante à 75 °C pendant plusieurs heures (jusqu’à ce qu’elles ne collent plus au toucher).
3. Placez une seule lamelle en verre revêtue d’élastomère dans la chambre de dissection en verre plexi fabriquée sur mesure pour la dissection larvaire.
4. Préparez les pipettes de colle à partir d’un capillaire en verre borosilicaté à l’aide d’un extracteur de microélectrode standard pour obtenir le cône et la taille de pointe souhaités.
5. Cassez doucement la pointe de la micropipette et, à l’autre extrémité, fixez 2 pieds de tube en plastique flexible (1/32 » de diamètre intérieur, ID ; 3/32 » de diamètre extérieur, OD ; 1/32 » de paroi ; avec raccord buccal (pointe de pipette P2).
6. En préparation de la dissection larvaire, remplissez un petit récipient (0,6 mL de capuchon de tube Eppendorf) avec un petit volume (~20 μL) de colle.
7. Remplissez la chambre avec du sérum physiologique (en mM) : 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl₂, 1 CaCl₂, 70 saccharose et 5 acide 2-[4-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-1-yl]éthanesulfonique (HEPES) pH 7,2.
8. Ajouter l’anticorps anti-peroxydase de raifort (HRP) conjugué à Alexa Fluor 647 (anti-HRP : 647 ; diluer 1:10 à partir d’un stock de 1 mg/mL) pour marquer la terminaison présynaptique NMJ pendant la dissection21,22.
9. À l’aide d’un pinceau fin (taille 2), retirez un troisième stade errant du flacon alimentaire et placez-le sur le verre de couverture recouvert d’élastomère.
10. Remplissez l’embout de la micropipette en verre avec un petit volume de colle en utilisant la pression d’air négative générée par la bouche avec l’accessoire (étape 1.5).
11. Positionnez la larve sur la face dorsale vers le haut à l’aide d’une pince et collez la tête sur la lamelle recouverte d’élastomère avec une petite goutte de colle en utilisant une pression d’air positive par la bouche.
12. Répétez cette procédure avec l'extrémité postérieure de la larve, en vous assurant que l'animal est tendu entre les deux attaches de colle.
13. À l’aide de ciseaux (lames de 3 mm), faites une coupe horizontale (~1 mm) à l’arrière et une coupe verticale tout le long de la ligne médiane dorsale.
14. À l’aide d’une pince fine (#5), retirez délicatement la trachée dorsale, l’intestin, le corps adipeux et les autres organes internes recouvrant la musculature.
15. Répétez la procédure de collage pour les quatre rabats de la paroi du corps ; étirez doucement la paroi du corps horizontalement et verticalement.
16. Soulevez le cordon nerveux ventral (VNC) à l’aide d’une pince, coupez soigneusement les nerfs moteurs avec les ciseaux, puis retirez complètement le VNC.
17. Pour arrêter le cycle SV, remplacez la solution saline de dissection par une solution saline sans Ca²⁺ (la même que la solution saline de dissection ci-dessus sans le CaCl₂).

2. Stimulation électrique Charge de colorant FM

1. Préparez une pipette d’aspiration à l’aide de l’extracteur de microélectrodes pour obtenir le cône et la taille de pointe requis.
2. Polissez au feu la pointe de la microélectrode avec une micro-forge jusqu’à ce qu’un seul nerf moteur puisse être aspiré avec un ajustement serré.
3. Faites glisser la pipette d’aspiration sur le porte-électrode d’un micromanipulateur et fixez-la au long tube en plastique flexible et à une seringue.
4. Réglez les paramètres du stimulateur (par exemple, fréquence 15 V, fréquence 20 Hz, durée 20 ms et durée de 5 min ou 1 min.
5. Remplacer la solution saline exempte de Ca²⁺ dans la préparation larvaire par la solution saline FM1-43 ci-dessus (4 μM ; 1 mM CaCl₂) dans le dispositif d’électrophysiologie.
6. Placez la préparation sur la platine du microscope et soulevez la platine jusqu’à ce que la larve et la pipette d’aspiration soient focalisées (objectif d’immersion dans l’eau 40X).
7. Aspirez une boucle de nerf moteur coupé innervant l’hémisegment sélectionné avec une pression d’air négative générée par la seringue dans l’électrode d’aspiration.
8. Testez la fonction de l’électrode d’aspiration avec une courte rafale de stimulation tout en surveillant visuellement la contraction musculaire dans l’hémisegment sélectionné.
9. Stimulez le nerf moteur à l’aide des paramètres sélectionnés (étape 2.4) pour stimuler l’endocytose SV et l’absorption du colorant FM1-43.
10. Lavez rapidement avec une solution saline sans Ca²⁺ (5x pendant 1 min) pour éliminer complètement la solution de colorant FM1-43.
11. Maintenir la préparation larvaire dans une solution saline fraîche exempte de Ca²⁺ pour une imagerie immédiate à l’aide du protocole d’imagerie confocale ci-dessus.
12. Prenez bien note de l’image NMJ (segment, côté et muscle) pour garantir l’accès au même NMJ après le déchargement du colorant FM.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
SylGard 184 Kit d’élastomère de silicone	Fisher Scientific	NC9644388	Mettre en place une vitre de protection pour les dissections
Couvercle de microscope en verre 22x22-1	Fisherbrand	12-542-B	Pour mettre SylGard pour les dissections
Plaque chauffante supérieure en aluminium de type 2200	Thermolyne	HPA2235M	Pour soigner le SylGard
Chambre de dissection en verre plexi	n/a	n/a	fait main
Capillaires en verre borosilicaté	WPI	1B100F-4	Pour fabriquer des micropipettes d’aspiration et de colle
Extracteur de micropipettes à base laser	Instrument Sutter	P-2000	Pour fabriquer des micropipettes d’aspiration et de colle
Tygon E-3603 Tube de laboratoire	Component Supply Co.	TET-031A	Pour pipette à bouche et pipette d’aspiration
Pointe de pipette P2	Scientifique américain	Référence 1111-3700	Pour pipette à bouche
Capuchon de tube Eppendorf de 0,6 mL	Fisher Scientific	Tél. : 05-408-120	Utilisé pour mettre de la colle pour la dissection
Vetbond 3M	WPI	Vetbond	Colle utilisée pour les dissections
chlorure de potassium	Fisher Scientific	P-217	Forsaline
chlorure de sodium	Millipore Sigma	S5886	Pour une solution saline
chlorure de magnésium	Fisher Scientific	M35-500	Pour une solution saline
Chlorure de calcium dihydraté	Millipore Sigma	Réf. C7902	Pour une solution saline
saccharose	Fisher Scientific	S5-3	Pour une solution saline
HEPES	Millipore Sigma	N° H3375	Pour une solution saline
HRP : Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	Tél. : 123-605-021	Pour marquer les membranes neuronales
pinceau	Winsor et Newton	94376864793	Pour manipuler les larves
Dumont Dumostar Pince à épiler #5	WPI	500233	Utilisé lors de la dissection
Microciseaux McPherson-Vannas de 7 cm (lames 3 mm)	WPI	Référence 14177	Utilisé lors de la dissection
FM1-43	Fisher Scientific	Réf. T35356	Colorant styryle fluorescent
Minuterie numérique	VWR	Référence 62344 à 641	Pour le chronométrage du chargement/déchargement du colorant FM
Micro-forge	WPI	MF200	Pour polir au feu les micropipettes en verre
Embout de seringue de 20 ml	Bd	301625	Pour aspirer l’axone pour la stimulation électrique.
Micro manipulateur (base magnétique)	Narishige	MMN-9	Pour contrôler l’électrode d’aspiration pour la stimulation électrique
stimulateur	herbe	S48	Pour contrôler la LED et la stimulation électrique
Microscope Zeiss Axioskop	Zeiss		Utilisé lors d’une stimulation électrique.
Objectif d’immersion dans l’eau 40X Achroplan	Zeiss		Utilisé lors de la stimulation électrique et de l’imagerie confocale
Microscope Zeiss Stemi avec port de caméra	Zeiss	2000-C	Utilisé lors de la stimulation par la channelrhodopsine
Pilote LED T-Cube	ThorLabs	LEDD1B	Pour contrôler la LED
Alimentation LED	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	Pour alimenter la LED
Compteur optique de puissance et d’énergie	ThorLabs	PM100D	Pour mesurer l’intensité des LED