1. Dissection de la colle larvaire
- Mélangez soigneusement 10 parties de base en élastomère de silicone avec 1 partie d’agent de durcissement en élastomère de silicone du kit d’élastomère (tableau des matériaux).
- Enduire d’élastomère des lamelles en verre de 22 x 22 mm et durcir sur une plaque chauffante à 75 °C pendant plusieurs heures (jusqu’à ce qu’elles ne collent plus au toucher).
- Placez une seule lamelle en verre revêtue d’élastomère dans la chambre de dissection en plexiglas faite sur mesure (figure 1, en bas) en préparation de la dissection larvaire.
- Préparez les pipettes de colle à partir d’un capillaire en verre borosilicaté à l’aide d’un extracteur de microélectrode standard pour obtenir le cône et la taille de pointe souhaités.
- Cassez doucement la pointe de la micropipette et, à l’autre extrémité, fixez 2 pieds de tube en plastique flexible (1/32 » de diamètre intérieur, ID ; 3/32 » de diamètre extérieur, OD ; 1/32 » de paroi ; Table des matériaux) avec raccord buccal (pointe de pipette P2).
- Remplissez un petit contenant (capuchon de tube Eppendorf de 0,6 ml) avec un petit volume (~20 μL) de colle (Table des matériaux) en préparation de la dissection larvaire.
- Remplissez la chambre avec du sérum physiologique (en mM) : 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl2, 1 CaCl2, 70 saccharose et 5 acide 2-[4-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-1-yl]éthanesulfonique (HEPES) pH 7,2.
- Ajouter l’anticorps anti-peroxydase de raifort (HRP) conjugué à Alexa Fluor 647 (anti-HRP : 647 ; diluer 1:10 à partir d’un stock de 1 mg/mL) pour marquer la terminaison présynaptique de la jonction neuromusculaire (JNM) pendant la dissection.
- À l’aide d’un pinceau fin (taille 2), retirez une larve errante du troisième stade de la fiole alimentaire et placez-la sur le verre de couverture recouvert d’élastomère.
- Remplissez l’embout de la micropipette en verre avec un petit volume de colle en utilisant la pression d’air négative générée par la bouche avec accessoire (étape 1.5).
- Positionner la larve sur le côté dorsal vers le haut à l’aide d’une pince et coller la tête sur la lamelle recouverte d’élastomère avec une petite goutte de colle en utilisant une pression d’air positive à la bouche.
- Répétez cette procédure avec l’extrémité postérieure de la larve, en vous assurant que l’animal est tendu entre les deux attaches de colle.
- À l’aide de ciseaux (lames 3 mm ; Table des matériaux), faites une coupe horizontale (~1 mm) à l’arrière et une coupe verticale tout le long de la ligne médiane dorsale.
- À l’aide d’une pince fine (#5, Table des matériaux), retirez délicatement la trachée dorsale, l’intestin, le corps adipeux et les autres organes internes recouvrant la musculature.
- Répétez la procédure de collage pour les quatre rabats de la paroi du corps, en veillant à étirer doucement la paroi du corps à l’horizontale et à la verticale.
- Soulevez le cordon nerveux ventral (VNC) à l’aide d’une pince, coupez soigneusement les nerfs moteurs avec des ciseaux, puis retirez complètement le VNC.
- Remplacez la solution saline de dissection par une solution saline sans Ca2+ (identique à la solution saline de dissection ci-dessus sans le CaCl2) pour arrêter le cycle des vésicules synaptiques (SV).
2. Imagerie : Microscopie confocale
- Utilisez un microscope confocal droit avec un objectif à immersion dans l’eau 40X pour imager la fluorescence du colorant NMJ (d’autres microscopes peuvent être utilisés).
- Imagez le muscle 4 NMJ des segments abdominaux 2 à 4 (d’autres NMJ peuvent être imagés) et collectez des images à l’aide d’un logiciel approprié (Table of Materials).
- Utilisez un laser HeNe 633 nm pour exciter HRP :647 (avec filtre passe-long > 635 nm) et un laser Argon 488 nm pour exciter FM1-43 (avec filtre passe-bande 530-600 nm).
- Déterminez de manière opérationnelle le gain et le décalage optimaux pour les deux canaux.
note: Ces paramètres resteront constants pendant le reste de l’expérience.
- Prenez une pile Z confocale à travers l’ensemble de la NMJ sélectionnée du haut vers le bas de la terminaison synaptique marquée HRP.
- Prenez bien note de l’imagerie NMJ (segment, côté et muscle) pour assurer l’excès jusqu’au même NMJ après le déchargement du colorant FM.
3. Stimulation de la canalrhodopsine FM Chargement du colorant
- Élever des larves exprimant la ChR2 sur des aliments contenant le cofacteur rétinien tout-trans ChR2 (dissous dans de l’éthanol ; concentration finale de 100 μM).
- Placez la préparation larvaire dans la chambre en plexiglas sur une platine de microscope de dissection équipée d’un port de caméra.
- Fixez une LED bleue (470 nm ; Table des matériaux) à un stimulateur programmable à l’aide d’un câble coaxial et placez la LED dans le port de la caméra.
- Focalisez le faisceau lumineux LED bleu sur la fonction larvaire disséquée à l’aide de la fonction de zoom du microscope.
- Remplacer la solution saline libre de Ca2+ sur la préparation larvaire par la solution saline FM1-43 ci-dessus (4 μM ; 1 mM CaCl2) sur le stade optogénétique.
- Réglez les paramètres de la LED à l’aide du stimulateur (par exemple, fréquence 15 V, fréquence 20 Hz, durée de 20 ms et durée de 5 min (Figure 2)).
- Démarrez la stimulation lumineuse et suivez avec une minuterie pour la durée prédéterminée de la période de stimulation optogénétique (par exemple, 5 min ; Figure 2).
- Lorsque la minuterie s’arrête, retirez rapidement la solution de colorant FM et remplacez-la par une solution saline sans Ca2+ pour arrêter le cycle SV.
- Lavez en succession rapide avec la solution saline sans Ca2+ (5x pendant 1 min) pour vous assurer que la solution de colorant FM est complètement éliminée.
- Maintenir la préparation larvaire dans une solution saline fraîche exempte de Ca2+ pour une imagerie immédiate au microscope confocal en utilisant le protocole d’imagerie.
- Prenez bien note de l’imagerie NMJ (segment, côté et muscle) pour assurer l’accès à exactement le même NMJ après le déchargement du colorant FM.
4. Stimulation par la rhodopsine : décharge de colorant FM
- Remplacez la solution saline sans Ca2+ par une solution saline ordinaire (sans colorant FM1-43) sur la platine du microscope de dissection avec la LED du port de la caméra focalisée sur la larve.
- Réglez les paramètres du stimulateur pour la décharge (par exemple, fréquence 15 V, fréquence 20 Hz, durée de 20 ms et durée de 2 min (Figure 2).
- Démarrez la stimulation lumineuse et suivez avec une minuterie pour la durée prédéterminée de la période de stimulation optogénétique (par exemple, 2 min ; Figure 2).
- À la fin de la période de minuterie, retirez rapidement la solution de colorant FM et remplacez-la par une solution saline sans Ca2+ pour arrêter le cycle SV.
- Laver successivement avec une solution saline sans Ca2+ (5x pendant 1 min) pour s’assurer que le colorant externe est complètement éliminé.
- Maintenir la préparation larvaire dans une solution saline fraîche exempte de Ca2+ pour une imagerie immédiate au microscope confocal.
- Assurez-vous d’imager la fluorescence du colorant FM1-43 au même NMJ indiqué ci-dessus en utilisant les mêmes paramètres confocaux.
