Analyse du recyclage des vésicules synaptiques et de l’absorption de colorant fluorescent chez les larves de drosophile

Résumé

Source : Kopke, D. L., et al., FM Cycle des colorants au niveau de la synapse : comparaison de la dépolarisation élevée du potassium, de la stimulation électrique et de la canalrhodopsine. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo présente un protocole permettant d’étudier le recyclage des vésicules synaptiques aux jonctions neuromusculaires chez des larves de drosophile exprimant la channelrhodopsine à l’aide d’un colorant fluorescent. La lumière bleue active les channelrhodopsines, provoquant un afflux de calcium et une exocytose des vésicules synaptiques. Le colorant s’intègre dans les membranes neuronales et est internalisé pendant l’endocytose, ce qui entraîne une fluorescence accrue. Une stimulation supplémentaire par la lumière bleue induit une exocytose et une libération de colorant, ce qui se traduit par une fluorescence réduite.

Protocole

1. Dissection de la colle larvaire

1. Mélangez soigneusement 10 parties de base en élastomère de silicone avec 1 partie d’agent de durcissement en élastomère de silicone du kit d’élastomère (tableau des matériaux).
2. Enduire d’élastomère des lamelles en verre de 22 x 22 mm et durcir sur une plaque chauffante à 75 °C pendant plusieurs heures (jusqu’à ce qu’elles ne collent plus au toucher).
3. Placez une seule lamelle en verre revêtue d’élastomère dans la chambre de dissection en plexiglas faite sur mesure (figure 1, en bas) en préparation de la dissection larvaire.
4. Préparez les pipettes de colle à partir d’un capillaire en verre borosilicaté à l’aide d’un extracteur de microélectrode standard pour obtenir le cône et la taille de pointe souhaités.
5. Cassez doucement la pointe de la micropipette et, à l’autre extrémité, fixez 2 pieds de tube en plastique flexible (1/32 » de diamètre intérieur, ID ; 3/32 » de diamètre extérieur, OD ; 1/32 » de paroi ; Table des matériaux) avec raccord buccal (pointe de pipette P2).
6. Remplissez un petit contenant (capuchon de tube Eppendorf de 0,6 ml) avec un petit volume (~20 μL) de colle (Table des matériaux) en préparation de la dissection larvaire.
7. Remplissez la chambre avec du sérum physiologique (en mM) : 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl₂, 1 CaCl₂, 70 saccharose et 5 acide 2-[4-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-1-yl]éthanesulfonique (HEPES) pH 7,2.
8. Ajouter l’anticorps anti-peroxydase de raifort (HRP) conjugué à Alexa Fluor 647 (anti-HRP : 647 ; diluer 1:10 à partir d’un stock de 1 mg/mL) pour marquer la terminaison présynaptique de la jonction neuromusculaire (JNM) pendant la dissection.
9. À l’aide d’un pinceau fin (taille 2), retirez une larve errante du troisième stade de la fiole alimentaire et placez-la sur le verre de couverture recouvert d’élastomère.
10. Remplissez l’embout de la micropipette en verre avec un petit volume de colle en utilisant la pression d’air négative générée par la bouche avec accessoire (étape 1.5).
11. Positionner la larve sur le côté dorsal vers le haut à l’aide d’une pince et coller la tête sur la lamelle recouverte d’élastomère avec une petite goutte de colle en utilisant une pression d’air positive à la bouche.
12. Répétez cette procédure avec l’extrémité postérieure de la larve, en vous assurant que l’animal est tendu entre les deux attaches de colle.
13. À l’aide de ciseaux (lames 3 mm ; Table des matériaux), faites une coupe horizontale (~1 mm) à l’arrière et une coupe verticale tout le long de la ligne médiane dorsale.
14. À l’aide d’une pince fine (#5, Table des matériaux), retirez délicatement la trachée dorsale, l’intestin, le corps adipeux et les autres organes internes recouvrant la musculature.
15. Répétez la procédure de collage pour les quatre rabats de la paroi du corps, en veillant à étirer doucement la paroi du corps à l’horizontale et à la verticale.
16. Soulevez le cordon nerveux ventral (VNC) à l’aide d’une pince, coupez soigneusement les nerfs moteurs avec des ciseaux, puis retirez complètement le VNC.
17. Remplacez la solution saline de dissection par une solution saline sans Ca²⁺ (identique à la solution saline de dissection ci-dessus sans le CaCl₂) pour arrêter le cycle des vésicules synaptiques (SV).

2. Imagerie : Microscopie confocale

1. Utilisez un microscope confocal droit avec un objectif à immersion dans l’eau 40X pour imager la fluorescence du colorant NMJ (d’autres microscopes peuvent être utilisés).
2. Imagez le muscle 4 NMJ des segments abdominaux 2 à 4 (d’autres NMJ peuvent être imagés) et collectez des images à l’aide d’un logiciel approprié (Table of Materials).
3. Utilisez un laser HeNe 633 nm pour exciter HRP :647 (avec filtre passe-long > 635 nm) et un laser Argon 488 nm pour exciter FM1-43 (avec filtre passe-bande 530-600 nm).
4. Déterminez de manière opérationnelle le gain et le décalage optimaux pour les deux canaux.
   note: Ces paramètres resteront constants pendant le reste de l’expérience.
5. Prenez une pile Z confocale à travers l’ensemble de la NMJ sélectionnée du haut vers le bas de la terminaison synaptique marquée HRP.
6. Prenez bien note de l’imagerie NMJ (segment, côté et muscle) pour assurer l’excès jusqu’au même NMJ après le déchargement du colorant FM.

3. Stimulation de la canalrhodopsine FM Chargement du colorant

1. Élever des larves exprimant la ChR2 sur des aliments contenant le cofacteur rétinien tout-trans ChR2 (dissous dans de l’éthanol ; concentration finale de 100 μM).
2. Placez la préparation larvaire dans la chambre en plexiglas sur une platine de microscope de dissection équipée d’un port de caméra.
3. Fixez une LED bleue (470 nm ; Table des matériaux) à un stimulateur programmable à l’aide d’un câble coaxial et placez la LED dans le port de la caméra.
4. Focalisez le faisceau lumineux LED bleu sur la fonction larvaire disséquée à l’aide de la fonction de zoom du microscope.
5. Remplacer la solution saline libre de Ca²⁺ sur la préparation larvaire par la solution saline FM1-43 ci-dessus (4 μM ; 1 mM CaCl₂) sur le stade optogénétique.
6. Réglez les paramètres de la LED à l’aide du stimulateur (par exemple, fréquence 15 V, fréquence 20 Hz, durée de 20 ms et durée de 5 min (Figure 2)).
7. Démarrez la stimulation lumineuse et suivez avec une minuterie pour la durée prédéterminée de la période de stimulation optogénétique (par exemple, 5 min ; Figure 2).
8. Lorsque la minuterie s’arrête, retirez rapidement la solution de colorant FM et remplacez-la par une solution saline sans Ca²⁺ pour arrêter le cycle SV.
9. Lavez en succession rapide avec la solution saline sans Ca²⁺ (5x pendant 1 min) pour vous assurer que la solution de colorant FM est complètement éliminée.
10. Maintenir la préparation larvaire dans une solution saline fraîche exempte de Ca²⁺ pour une imagerie immédiate au microscope confocal en utilisant le protocole d’imagerie.
11. Prenez bien note de l’imagerie NMJ (segment, côté et muscle) pour assurer l’accès à exactement le même NMJ après le déchargement du colorant FM.

4. Stimulation par la rhodopsine : décharge de colorant FM

1. Remplacez la solution saline sans Ca²⁺ par une solution saline ordinaire (sans colorant FM1-43) sur la platine du microscope de dissection avec la LED du port de la caméra focalisée sur la larve.
2. Réglez les paramètres du stimulateur pour la décharge (par exemple, fréquence 15 V, fréquence 20 Hz, durée de 20 ms et durée de 2 min (Figure 2).
3. Démarrez la stimulation lumineuse et suivez avec une minuterie pour la durée prédéterminée de la période de stimulation optogénétique (par exemple, 2 min ; Figure 2).
4. À la fin de la période de minuterie, retirez rapidement la solution de colorant FM et remplacez-la par une solution saline sans Ca²⁺ pour arrêter le cycle SV.
5. Laver successivement avec une solution saline sans Ca²⁺ (5x pendant 1 min) pour s’assurer que le colorant externe est complètement éliminé.
6. Maintenir la préparation larvaire dans une solution saline fraîche exempte de Ca²⁺ pour une imagerie immédiate au microscope confocal.
7. Assurez-vous d’imager la fluorescence du colorant FM1-43 au même NMJ indiqué ci-dessus en utilisant les mêmes paramètres confocaux.

Résultats

Figure 1 : Organigramme du protocole de chargement du colorant FM1-43 chez la NMJ de la drosophile. La dissection de la colle larvaire produit une préparation de neuromusculature aplatie, avec le cordon nerveux ventral (VNC) projetant les nerfs segmentaires de la ligne médiane ventrale (Vm) vers les réseaux musculaires de la paroi corporelle répétés hémisegmentairement (étape a). Le VNC est co...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
SylGard 184 Kit d’élastomère de silicone	Fisher Scientific	NC9644388	Mettre en place une vitre de protection pour les dissections
Couvercle de microscope en verre 22x22-1	Fisherbrand	12-542-B	Pour mettre SylGard pour les dissections
Plaque chauffante supérieure en aluminium de type 2200	Thermolyne	HPA2235M	Pour soigner le SylGard
Chambre de dissection en verre plexi	n/a	n/a	fait main
Capillaires en verre borosilicaté	WPI	1B100F-4	Pour fabriquer des micropipettes d’aspiration et de colle
Extracteur de micropipettes à base laser	Instrument Sutter	P-2000	Pour fabriquer des micropipettes d’aspiration et de colle
Tygon E-3603 Tube de laboratoire	Component Supply Co.	TET-031A	Pour pipette à bouche et pipette d’aspiration
Pointe de pipette P2	Scientifique américain	Référence 1111-3700	Pour pipette à bouche
Capuchon de tube Eppendorf de 0,6 mL	Fisher Scientific	Tél. : 05-408-120	Utilisé pour mettre de la colle pour la dissection
Vetbond 3M	WPI	Vetbond	Colle utilisée pour les dissections
chlorure de potassium	Fisher Scientific	P-217	Forsaline
chlorure de sodium	Millipore Sigma	S5886	Pour une solution saline
chlorure de magnésium	Fisher Scientific	M35-500	Pour une solution saline
Chlorure de calcium dihydraté	Millipore Sigma	Réf. C7902	Pour une solution saline
saccharose	Fisher Scientific	S5-3	Pour une solution saline
HRP : Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	Tél. : 123-605-021	Pour marquer les membranes neuronales
HEPES	Millipore Sigma	N° H3375	Pour une solution saline
pinceau	Winsor et Newton	94376864793	Pour manipuler les larves
Dumont Dumostar Pince à épiler #5	WPI	500233	Utilisé lors de la dissection
Microciseaux McPherson-Vannas de 7 cm (lames 3 mm)	WPI	Référence 14177	Utilisé lors de la dissection
FM1-43	Fisher Scientific	Réf. T35356	Colorant styryle fluorescent
Minuterie numérique	VWR	Référence 62344 à 641	Pour le chronométrage du chargement/déchargement du colorant FM
LSM 510 META microscope confocal à balayage laser	Zeiss		Pour l’imagerie des marqueurs fluorescents
Zen 2009 SP2 version 6.0	Zeiss		Logiciel d’imagerie sur confocal
Laser HeNe 633nm	Lasos	Pour exciter HRP :647 pendant l’imagerie
Laser à argon 488 nm	Lasos		Pour exciter le colorant FM pendant l’imagerie
Micro-forge	WPI	MF200	Pour polir au feu les micropipettes en verre
stimulateur	herbe	S48	Pour contrôler la LED et la stimulation électrique
Rétinien tout-trans	Millipore Sigma	R2500	Cofacteur essentiel pour ChR2
Microscope Zeiss Stemi avec port de caméra	Zeiss	2000-C	Utilisé lors de la stimulation par la channelrhodopsine
LED 470nm	ThorLabs	M470L2	Utilisé pour l’activation du ChR
Pilote LED T-Cube	ThorLabs	LEDD1B	Pour contrôler la LED
Alimentation LED	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	Pour alimenter la LED
Compteur optique de puissance et d’énergie	ThorLabs	PM100D	Pour mesurer l’intensité des LED
Objectif d’immersion dans l’eau 40X Achroplan	Zeiss	Utilisé lors de la stimulation électrique et de l’imagerie confocale