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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation de l’animal :
- Anesthésier le rat à l’aide d’un inhalant (isoflurane) à 1-2 % délivré pour effet ou par injection (kétamine, xylazine, acépromazine). La posologie de l’anesthésie injectable est la suivante : 95,0 mg/kg de kétamine, 10,0 mg/kg de xylazine, 0,075 mg/kg d’acépromazine.
note: Nous utilisons avec succès des approches anesthésiques inhalées et injectables lors de la réalisation de ce protocole d’enregistrement CMAP, sans préférence.
- L’animal doit être maintenu à la profondeur anesthésique appropriée avant le début de la chirurgie, jusqu’à la fin de la chirurgie et jusqu’à ce que la buprénorphine postopératoire ait fait effet. Confirmez l’anesthésie appropriée par un bref pincement des orteils pour déterminer qu’une réponse de retrait n’est pas déclenchée. De plus, testez le réflexe cornéen avec un coton-tige. Tout au long de l’intervention chirurgicale, déterminez que la fréquence cardiaque et la fréquence respiratoire n’ont pas augmenté, ce qui suggère que la profondeur de l’anesthésique est devenue trop faible.
- Appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux de l'animal pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
- Le chirurgien doit se laver les mains avec un désinfectant (gommage à la chlorhexidine) avant de commencer l’opération. Le chirurgien doit porter des gants stériles, un masque facial et une blouse ou une blouse de laboratoire propre. Tous les instruments doivent être lavés et autoclavés avant l’opération. Ajouter une bande indicatrice de stérilisation à l’intérieur de la trousse d’instruments avant l’autoclave au niveau des instruments pour vérifier que la stérilisation est complète. Le chirurgien doit vérifier que toute la ligne de la bande est noire avant de commencer l’opération. Collez également l’extérieur de la boîte avec du ruban adhésif d’autoclave indicateur. Si une intervention chirurgicale doit être pratiquée sur plusieurs animaux le même jour, nettoyez les instruments entre les chirurgies et stérilisez-les dans un stérilisateur à billes de verre. Si nécessaire, stérilisez les deux extrémités de l’instrument dans le stérilisateur à billes de verre en plaçant la poignée de l’instrument dans le stérilisateur pendant le temps approprié, en retirant l’instrument avec un hémostat stérile, en le refroidissant dans un champ stérile, puis en plaçant l’extrémité fonctionnelle de l’instrument dans le stérilisateur à billes de verre pendant la période appropriée.
- Une fois l'animal anesthésié, placez-le sur une planche chirurgicale avec la surface dorsale vers le bas et l'abdomen vers le haut afin que du ruban puisse être utilisé pour fixer les membres antérieurs de l'animal à la planche chirurgicale.
- Rasez la surface ventrale caudale en commençant à la base du crâne et assurez-vous que la zone autour de l’abdomen de chaque côté de la ligne médiane est rasée en fonction de l’hémi-diaphragme enregistré. Appliquez de la povidone iodée sur la surface rasée de la peau.
2. Préparation aux enregistrements CMAP :
- Après la préparation de l’animal, placez l’électrode de terre par voie sous-cutanée dans la queue (figure 1).
- Placez l’électrode de référence par voie sous-cutanée dans la région pré-abdominale inférieure controlatérale.
- Placez le gel conducteur sur une bande de surface autocollante ou une électrode d’enregistrement de disque (dimensions de l’électrode de la bande de surface : 0,5 x 3 cm), puis placez l’électrode de surface transversalement le long de la marge costale unilatérale.
- Placez les électrodes de stimulation par voie transcutanée à 0,5 cm de distance, latéralement à la trachée et au-dessus de la clavicule. Insérez les électrodes à environ 1,0 cm de profondeur dans la peau. Fixez les électrodes à la main afin que leur emplacement ne se déplace pas lors des stimulations ultérieures.
note: Électrodes de stimulation angulaire de 90° par rapport à la peau au site d’insertion.
3. Enregistrements du potentiel d’action musculaire composé (CMAP) :
- Obtenir des enregistrements électrophysiologiques à l’aide d’un stimulateur/amplificateur suivi d’une analyse de données assistée par ordinateur.
- Les paramètres de stimulus de la stimulation par traction unique doivent être des impulsions supramaximales de 0,5 ms, 1,0 Hz. L’amplitude du stimulus doit être comprise entre 6,0 et 8,0 V (Figure 2A).
note: Dans le cadre d’une expérience, utilisez une intensité de stimulus de la même amplitude sur tous les animaux. L’objectif est de maximiser l’amplitude de réponse en utilisant l’amplitude minimale de stimulation. Il est important de noter que la réponse initiale qui se produit au moment de la stimulation est un artefact de stimulation. De plus, il faut veiller à obtenir une réponse CMAP qui est précédée d’une ligne de base stable/plate après l’artefact de stimulation, qui est ensuite suivie d’une réponse CMAP rapide. Pour obtenir une telle réponse, il peut être nécessaire de repositionner les électrodes de stimulation et/ou d’enregistrement.
- Attendez 30 secondes entre les stimulations et répétez 10 stimulations d’affilée pour obtenir la réponse moyenne (Figure 2B-C). Mesurez l’amplitude de la ligne de base au pic (Figure 2A). Effectuer une stimulation du nerf phrénique pendant la phase du cycle respiratoire de l'animal lorsque le nerf/diaphragme phrénique n'est pas activé. La procédure peut être répétée sur le même animal pour l’hémi-diaphragme controlatéral.
- Après la dernière séance d’enregistrement CMAP, perfuser l’animal si une coloration de la jonction neuromusculaire du diaphragme (JNM) sera effectuée. Effectuer des enregistrements CMAP répétés sur le même animal environ une fois par semaine (ou à des intervalles de choix).
- Après les enregistrements CMAP de survie, laisser l’animal se rétablir sur un coussin chauffant d’eau chaude en circulation, et surveiller continuellement pendant la récupération jusqu’à ce qu’il soit réveillé et couché sur le sterne. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale en compagnie d’autres animaux avant qu’il ne soit complètement rétabli.
- Une fois couché sur le dos, surveillez l’animal toutes les 12 heures pendant les 48 premières heures (une fois par jour par la suite). Si l’animal semble déshydraté (peau flasque, apathie), administrer des liquides (solution de sonneries lactées ; sous-cutanée ; 1 à 2 ml par injection, avec les sites tournés ; 2 fois par jour) jusqu’à ce que le poids post-chirurgical et la perte de liquide se stabilisent. Fournir aux animaux de la nourriture ramollie dans de petits plats pendant la période postopératoire aiguë si nécessaire pour les encourager à manger s’ils ne peuvent pas atteindre la mangeoire à couvercle de barre métallique.
- Administrer la buprénorphine à une dose de 0,05 mg/kg avant la fin de la chirurgie, puis à 12 heures d’intervalle pendant les premières 24 heures (et en fonction des signes de douleur/stress par la suite) par injection sous-cutanée (rotation du site). Si des signes de douleur ou de détresse sont remarqués par la suite, traitez les animaux avec de la buprénorphine. Les signes indiquant une douleur ou une détresse comprennent le manque d’activité, les vocalisations, le manque de manger ou de boire (déshydratation), une perte de poids excessive, une protection, un rongement ou un grattage excessif au site de l’incision. D’autres critères utilisés pour déterminer la douleur et la détresse comprennent l’absence de réponse aux stimuli étrangers, la vocalisation transitoire ou non provoquée, la respiration laborieuse ou anormale, l’écoulement naso-oculaire persistant brun rougeâtre, la piloérection marquée. Surveillez également les signes d’une mauvaise hygiène qui pourraient suggérer que les animaux sont malades. Si l’on observe toujours que l’animal est en détresse après 72 heures de traitement (selon les critères douleur/stress décrits ci-dessus, et après avoir reçu le protocole analgésique décrit ci-dessus), euthanasier l’animal.
