in vivo Imagerie calcique à l’aide de capteurs calciques localisés synaptiquement chez Drosophila melanogaster

Résumé

Source : Hancock, C. E. et al., Imagerie calcique optique in vivo de la plasticité synaptique induite par l’apprentissage chez Drosophila melanogaster.J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo présente une méthode d’imagerie calcique in vivo utilisant des capteurs de calcium localisés synaptiquement chez les mouches. Il décrit les étapes de préparation des mouches pour la microscopie, la réalisation d’un conditionnement olfactif et la visualisation de l’afflux de calcium induit par les odeurs.

Protocole

1. Mouches des fruits transgéniques, Drosophila melanogaster

1. Croisez des mouches vierges et mâles femelles (élevées à 25 °C dans une humidité relative de 60 % sur un cycle lumière/obscurité de 12 heures) portant respectivement les constructions Gal4 et UAS souhaitées pour produire des mouches chez lesquelles des neurones spécifiques d’intérêt expriment un indicateur de calcium génétiquement codé.
2. Vieillir la progéniture femelle du croisement ci-dessus jusqu’à ce qu’elle soit dans la gamme de 3 à 6 jours après l’éclosion. Les mouches femelles sont préférables en raison de leur taille légèrement plus grande.

2. Préparation de la mouche des fruits pour l’imagerie calcique in vivo

1. Sélectionnez une seule mouche femelle et anesthésez-la sur de la glace pendant pas plus de 5 minutes.
2. À l’aide d’une pince fine, placez la mouche dans la chambre d’imagerie (illustrée à la figure 1c). Assurez-vous que le thorax et les pattes sont en contact avec les fils électriques au fond de la chambre et que la tête repose à plat. Fixez la position de la mouche à l’aide de ruban adhésif transparent.
   note: Ce protocole nécessite une chambre construite sur mesure dans laquelle les mouches sont fixées, avec la capsule céphalique accessible pour l’ouverture, et les mouches peuvent recevoir à la fois des stimulations olfactives aux antennes et des chocs électriques au thorax et aux pattes (Figure 1).
3. À l’aide d’une lame de scalpel chirurgicale fixée au manche du scalpel (voir le tableau des matériaux), découpez une fenêtre dans le ruban adhésif autour de la tête de la mouche, en laissant les antennes couvertes et seule la partie antérieure du thorax exposée.
4. Entourez les côtés et l’arrière de la tête d’une colle photopolymérisable, soigneusement manipulée à l’aide d’une épingle à insectes maintenue par des mâchoires concaves-convexes. Réglez la colle à l’aide d’une lampe LED électroluminescente bleue.
5. Vérifiez que la colle est complètement prise et éliminez toute colle non durcie résiduelle de la surface dorsale de la tête de mouche.
6. Appliquez une goutte de la solution de Ringer (voir le tableau des matériaux) pour couvrir la cuticule exposée de la tête.
7. À l’aide d’un couteau à lame très fine, coupez la cuticule. Pour l’élimination la plus efficace de la cuticule, coupez d’abord l’arrière de la tête en utilisant les ocelles comme point de départ. Ensuite, découpez chaque côté, au milieu des yeux, pour former un rabat de la cuticule qui peut être facilement arraché à l’aide d’une pince.
8. Retirez tout excès de cuticule qui pourrait bloquer la région cérébrale d’intérêt.
9. Nettoyez soigneusement la surface dorsale de toute trachée à l’aide d’une pince fine, en évitant de perturber le tissu cérébral lui-même. Retirez et rafraîchissez la solution de Ringer (voir le tableau des matériaux) au besoin pour dégager la zone des débris tissulaires.
10. Placez l’aiguille de diffusion des odeurs hypodermiques dans une position à environ 1 cm de la tête de la mouche. Assurez-vous qu’il n’y a rien qui pourrait entraver la transmission des odeurs aux antennes.
11. Au microscope, connectez la chambre d’imagerie au système de diffusion des odeurs via l’aiguille hypodermique de diffusion des odeurs.
12. Pour permettre à la mouche de se remettre complètement de l’anesthésie et de la chirurgie, et de s’adapter au flux d’air, mettez en place une période de repos de 10 minutes à ce stade.

3. Imagerie calcique in vivo

1. Utilisez un microscope multiphotonique équipé d’un laser infrarouge et d’un objectif d’immersion dans l’eau (voir Tableau des matériaux), installé sur une table isolée des vibrations. Pour la visualisation d’indicateurs calciques basés sur la protéine fluorescente verte (GFP), réglez le laser sur une longueur d’onde d’excitation de 920 nm et installez un filtre passe-bande GFP.
2. À l’aide du bouton de réglage Z grossier, balayez l’axe Z du cerveau et localisez la région cérébrale d’intérêt. Utilisez la fonction de recadrage pour concentrer la numérisation uniquement sur cette zone afin de minimiser le temps de numérisation et de faire pivoter la vue de numérisation de sorte que la partie antérieure de la tête soit tournée vers le bas.
3. Ajustez la taille de l’image à 512 x 512 px, la vitesse de balayage à > 4 Hz et la région de balayage (dans la dimension Y) de manière à ce que les neurones d’intérêt soient couverts.

4. Visualisation des transitoires calciques évoqués par l’odeur grâce au conditionnement olfactif

1. Utilisez un système de diffusion d’odeurs qui peut délivrer plusieurs stimuli olfactifs de manière temporellement précise.
   1. Utilisez un ordinateur supplémentaire pour contrôler l’appareil et pour communiquer avec le logiciel du microscope imageur afin de coordonner les stimulations olfactives avec la capture d’images pendant les expériences.
   2. Lancez un progiciel de macros préprogrammé capable de relier le logiciel d’acquisition d’images et le programme de diffusion des odeurs (par exemple, un progiciel de macros VBA installé dans le logiciel de contrôle du microscope, voir le Tableau des matériaux) qui répond à un déclencheur d’entrée externe fourni par le lancement d’un protocole de diffusion des odeurs dans un programme distinct).
2. Commencez la mesure en surveillant les transitoires calciques évoqués par les odeurs « pré-entraînement »/naïfs à une résolution de 512 x 512 px et une fréquence d’images de 4 Hz. Délivrez un stimulus olfactif de 2,5 s flanqué d’une acquisition d’image supplémentaire pendant 6,25 s avant l’apparition de l’odeur (pour établir une valeur de base de F₀) et 12,5 s après le décalage d’odeur. Répétez cette opération avec un deuxième odorant, puis avec un troisième odorisant.
3. Continuer 3 min après cette mesure avec un conditionnement classique (« dressage ») de la mouche.
   1. Sélectionnez l’une des odeurs présentées dans la phase de « pré-entraînement » pour devenir l’odeur de stimulus conditionné (CS⁺) et une autre pour devenir l’odeur CS^-. Présentez l’odeur CS⁺ à l’aide du système de distribution d’odeurs contrôlé par ordinateur pendant 60 s avec douze chocs électriques de 90 V.
   2. Après une pause de 60 s, présentez l’odeur CS^- seule pendant 60 s. Utilisez comme odorants le 4-méthylcyclohexanol et le 3-octanol. Ne présentez pas le troisième odorant (par exemple, 1-octen-3-ol) pendant cet entraînement car il n’est utilisé comme contrôle qu’avant (étape 4.2.) et après (étape 4.4) la phase d’entraînement.
4. Mesurez à nouveau les transitoires calciques évoqués par les odeurs « post-entraînement » en répétant le protocole de stimulation des odeurs « pré-entraînement » (étape 4.2.) 3 min après la fin de la phase d’entraînement (étape 4.3).
   note: Le moment de cette étape doit refléter le temps d’intérêt après la formation de la mémoire (par exemple, effectuez cette étape 3 à 4 minutes après l’étape de conditionnement pour étudier la mémoire à court terme). En règle générale, les mouches peuvent survivre plusieurs heures dans cette préparation.
5. Enregistrez les fichiers d’imagerie dans un format approprié (par exemple, Tiff) pour une analyse ultérieure des images.

5. Analyse d’images

1. Pour analyser des images, ouvrez des fichiers Tiff (ou similaires) dans un logiciel d’analyse d’images tel que Fiji.
2. Alignez les piles à l’aide d’un algorithme de correction de mouvement pour garantir un mouvement minimal dans les directions X et Y. Ignorez tous les enregistrements qui montrent un fort mouvement dans l’axe Z.
3. Sélectionnez l’outil logiciel utilisé pour marquer une zone d’intérêt (ROI) autour de la zone à examiner. Celle-ci doit être aussi précise que possible pour limiter l’influence de la fluorescence de fond.
4. Utilisez l’outil logiciel correspondant pour extraire les données d’intensité de fluorescence temporelle sous forme de fichiers de données à partir de la valeur d’intérêt sélectionnée, de sorte qu’une valeur soit générée pour chaque image de l’enregistrement.
5. Ouvrez les données à l’aide d’un programme d’analyse de données pour calculer les valeurs ΔF/F₀ pour chaque trace d’odeur. F₀ = fluorescence moyenne dans les 2 s précédant l’apparition de l’odeur. ΔF = la différence entre la fluorescence brute dans une image donnée et F₀. À partir de ces valeurs, calculez une valeur ΔF/F₀ pour chaque image, qui peut être tracée en fonction du temps pour refléter la fluorescence relative tout au long de la période de stimulus olfactif.

Résultats

Figure 1 : Construction d’une chambre de montage et préparation d’une mouche pour l’imagerie.a) Étapes de construction de la chambre de montage des mouches. La base est formée d’une lame de microscope standard (1) recouverte d’un fin treillis en plastique (2). Deux fils électriques porteurs de charges opposées (3) sont collés à la glissière de chaque côté. Les fils sont dénudé...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1-octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	O5284	Produit chimique utilisé comme odorisant
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	218405	Produit chimique utilisé comme odorisant
4-méthylcyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	153095	Produit chimique utilisé comme odorisant
Filtre passe-bande pour EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Iéna, Allemagne
Ruban adhésif transparent	Tesa SE, Norderstedt, Allemagne		Ruban adhésif transparent standard
Mâchoires concaves-convexes	Outils scientifiques fins, North Vancouver, Canada	Référence 10053-09	Porte-lames avec mâchoires concaves-convexes
Pinces fines	Outils scientifiques fins, North Vancouver, Canada	Référence 11412-11	Pince avec pointe 0,1 x 0,06 mm
aiguille hypodermique	Sterican - B. Braun, Melsungenk, Allemagne	4665120	1,20 x 40 millimètre
Pin’s Minutien d’insectes	Outils scientifiques fins, North Vancouver, Canada	Référence 26002-10	Diamètre 0,1 mm, pointe 0,0125 mm
Kentoflow	Kent Express Dental Supplies, Gillingham, Royaume-Uni	953683	Colle photopolymérisable bleue
Lame de microscope	Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Allemagne	656,1	Glissière d’objectif standard 76 x 26 mm
huile minérale	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	Référence M8410	Utilisé comme diluant pour les odorisants
Laser Ti-Sapphire Chameleon Vision 2 à verrouillage de mode	Coherent Inc., Santa Clara, Californie, États-Unis		Laser femtoseconde infrarouge accordable
Microscope multiphotonique LSM 7MP équipé de détecteurs BiG	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Iéna, Allemagne		Microscope multiphotonique, plusieurs entreprises fournissent des appareils similaires.
Objectif d’immersion dans l’eau Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Iéna, Allemagne	Référence 421452-9900-000	Objectif W « Plan-Apochromat » 20x/1.0 DIC M27 70mm
La solution de Ringer	N.A.	N.A.	5 mM de KCl, 130 mM de NaCl, 2 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2, 5 mM d’Hepes-NaOH, 36 mM de saccharose, pH = 7,4
Couteau à couteau	Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, Pennsylvanie, États-Unis	Référence 72-1551	Profondeur de lame droite limitée de 5,0 mm
Lame de scalpel chirurgical	Swann-Morton, Sheffield, Royaume-Uni	303	Produit n° 11
Manche de scalpel chirurgical	Swann-Morton, Sheffield, Royaume-Uni	907	N° de produit 7S/S
Le logiciel Visual Basics of Applicatons (VBA) pour recevoir un déclencheur de l’appareil de diffusion d’odeurs et le dispositif d’application de chocs électriques (alimentation) pour interagir avec le logiciel ZEN de Zeiss qui contrôle le microscope.	Écrit sur mesure et disponible sur demande	N.A.	N.A.