1. Configuration avant les enregistrements
- Préparez les solutions d’enregistrement avec les concentrations ioniques indiquées dans le tableau 1.
- Préparer 15 mL de solutions mères de 2 M dans de l’eau ultrapure pour le MgCl2, le CaCl2, le KCl et le CsCl.
- Peser les composants solides pour 100 mL de solutions intracellulaires et 500 mL de solutions tamponnées extracellulaires conformément au tableau 1 dans des béchers séparés et ajouter ensuite la quantité respective de solutions mères préparées. Par exemple, pour le tampon intracellulaire, utiliser 0,3803 g (10 mM) d’EGTA (acide tétraacétique d’éthylène glycol), 0,2383 g (10 mM) d’acide HEPES(4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique) et 0,6428 g (110 mM) de NaCl et ajouter 100 μL des solutions mères 2 M MgCl2 et CaCl2 et 50 μL des solutions mères 2 M KCl et CsCl.
- Ajoutez de l’eau ultrapure et ajustez soigneusement le pH à l’aide d’acides et de bases, qui n’interfèrent pas avec la mesure, c’est-à-dire qui ne sont pas effectués par les ChR (Channelrhodopsines), tels que l’acide citrique et la N-méthyl-D-glucamine (NMG+).
- Ajuster l’osmolarité à 290 mOsm pour les solutions intracellulaires et à 320 mOsm pour les solutions extracellulaires avec glucose.
note: Des solutions intracellulaires légèrement hypoosmotiques augmentent le taux de réussite du patching.
- Filtrer stérilement toutes les solutions à travers des filtres de 0,22 μm. Conservez les solutions à 4 °C pendant deux semaines ou congelez-les à -20 °C pour un stockage à long terme.
- Calculer les potentiels de jonction liquide et préparer les protocoles d’enregistrement.
REMARQUE : La modification de la concentration de chlorure extracellulaire après l’établissement de la configuration de la cellule entière entraîne un potentiel de jonction liquide (LJP) significatif qui doit être corrigé. Les LJP peuvent être directement mesurés ou calculés, ici, c’est cette dernière option qui est utilisée. Dans ce protocole, la correction en ligne sera utilisée, exigeant un protocole d’enregistrement pour chaque tampon externe. Cependant, pour un plus grand nombre de solutions externes, une post-correction de LJP est recommandée pour éviter une fausse correction.
- Ouvrez le calculateur de potentiel de jonction (JPC) et ouvrez la boîte de dialogue « Nouvelle expérience ». Sélectionnez ensuite « Mesures de patch-clamp ». Sélectionnez « Mesures sur cellules entières » et « Électrode de solution saline étalon » et entrez une température de 25 °C. Entre chaque étape, avancez en acceptant la sélection en appuyant sur le bouton « suivant ».
REMARQUE : Les expériences sont réalisées à une température ambiante de 25 °C dans un laboratoire climatisé. Assurez-vous que les solutions tampons ont une température ambiante avant de commencer les expériences. Pour faire varier la température de l’échantillon, une étape ou une chambre d’incubation peut être utilisée. La température du bain peut être mesurée fréquemment à l’aide d’un thermomètre.
- Ajouter toutes les concentrations individuelles d’anions et de cations de la solution pipetée et du tampon à haute teneur en chlorure conformément aux concentrations indiquées dans le tableau 1.
note: Le JPC calculera un LJP de -0,5 mV pour les conditions de départ.
- Cliquez sur « Nouvelle solution de bain » pour entrer la composition anionique et cationique du tampon à faible teneur en chlorure.
note: Le JPC va maintenant calculer un nouveau LJP de +12,6 mV selon la solution d’enregistrement extracellulaire modifiée.
- Préparez deux protocoles corrigés par le LJP pour les deux conditions de mesure en soustrayant le LJP calculé du potentiel de maintien appliqué : -0,5 mV pour les solutions externes à haute teneur en chlorure et +12,6 mV pour les solutions externes à faible teneur en chlorure. Ainsi, les protocoles commencent respectivement avec -79,5 mV (teneur élevée en chlorure) et -92,6 mV (teneur faible en chlorure), pour obtenir un potentiel de maintien de départ corrigé de la LJP de -80 mV dans les deux cas.
note: Les étapes suivantes s’appliquent aux logiciels d’acquisition de données mentionnés dans la liste des matériaux.
- Ouvrez l’éditeur de protocole dans le logiciel d’acquisition. Dans le menu « Mode », sélectionnez « Stimulation épisodique » et incluez 7 balayages.
- Passez au menu « Forme d’onde » de l’éditeur et incluez une période de 200 ms avec un potentiel de maintien de 0 mV suivie d’une période de 2 s avec un potentiel de maintien variable à partir de -79,5 mV pour un chlorure élevé. Inclure un « niveau delta » de 20 mV pour la deuxième période afin d’augmenter le potentiel de maintien de 20 mV à chaque balayage.
- Dans les pas de tension de l’éditeur de forme d’onde, appliquez une période d’éclairage de 500 ms avec une lumière de 540 nm (3,10 mW/mm²). Pour ce faire, modifiez le « motif binaire numérique » de l’obturateur connecté qui contrôle la source lumineuse pour qu’elle soit active 500 ms après la deuxième période décrite ci-dessus (voir 1.2.6).
note: L’intensité lumineuse peut influencer les propriétés biophysiques des courants de canal comme l’amplitude ou l’inactivation. Par conséquent, les densités de puissance lumineuse doivent toujours être signalées. Pour mesurer la puissance lumineuse après le passage à travers toutes les optiques et la lamelle, utilisez un optomètre calibré. Pour calculer la densité de puissance, déterminez le champ lumineux de l’objectif à l’aide d’un micromètre d’objet et divisez la puissance lumineuse mesurée par le champ lumineux déterminé.
- Conservez le protocole pour la solution extracellulaire à haute teneur en chlorure. Modifier le protocole et remplacer le potentiel de maintien de premier niveau par -92,6 mV (faible teneur en chlorure externe). Enregistrez ce deuxième protocole pour mesurer l’état extracellulaire à faible teneur en chlorure.
- Revêtement à la lysine des lamelles en verre selon un protocole adapté.
- Placez plusieurs 100 lamelles dans une boîte de Pétri en verre et ajoutez 250 mL de HCl (1 N).
- Placez la boîte de Pétri avec les lamelles sur un agitateur linéaire. Agitez à 120 tr/min pendant 72 h pour nettoyer les lamelles, puis rincez à l’eau ultra-pure pour neutraliser le pH.
- Faites-les tremper dans un petit volume d’éthanol à 95 % pour un nettoyage ultérieur.
REMARQUE : Les lamelles propres peuvent être stockées dans de l’éthanol à 70 % avant de continuer. Travaillez sous une hotte à flux laminaire pour les étapes suivantes.
- À l’aide d’un bec Bunsen et d’une pince à épiler, allumez chaque lamelle et transférez-la dans une nouvelle boîte de Pétri.
- Incuber les lamelles en verre avec une solution stérile de poly-D-lysine de 50 μg/mL pendant au moins 1 h (ou toute la nuit) à température ambiante tout en agitant avec un agitateur linéaire à 150 tr/min.
- Lavez les lamelles avec de l’eau ultra-pure pour éliminer l’excès de poly-D-lysine.
- Étalez les lamelles sur du papier stérile pour les faire sécher pendant 10 minutes et exposez-les à la lumière UV (ultraviolette) pour la stérilisation (au moins 20 minutes).
- Recueillir les lamelles dans une boîte de Pétri stérile recouverte de papier d’aluminium jusqu’à utilisation.
- Préparez l’ADN du gène PsACR1 fusionné à mCherry à l’aide de techniques de biologie moléculaire standard.
- Clonez la séquence du gène optimisée par le codon humain codant pour PsACR1 dans un plasmide peGFP-C1 (promoteur du CMV (cytomégalovirus), résistance à la kanamycine) dans le cadre du fluorophore mCherry à l’aide d’enzymes de restriction ou d’autres méthodes de clonage établies.
Remarque : D’autres fluorophores peuvent également être utilisés, mais assurez-vous d’avoir les jeux de filtres correspondants disponibles pour observer leur fluorescence au microscope dans la configuration.
- Transformez l’ADN plasmidique en cellules E. coli XL1Blue chimiocompétentes par choc thermique conformément au protocole standard et déposez-les sur des plaques de gélose (30 μg/mL de kanamycine). Cultivez les bactéries en boîte pendant une nuit à 37 °C.
- Le lendemain, inoculer 4 mL de milieu de bouillon de lysogénie complété par 30 μg/mL de kanamycine avec des cellules de colonies individuelles et les incuber pendant la nuit à 37 °C et 180 tr/min dans un incubateur.
- Après une nuit d’incubation, purifier l’ADN plasmidique des cultures à l’aide d’un kit disponible dans le commerce selon les instructions du fabricant.
- Ensemencer les cellules
REMARQUE : Effectuez les étapes sous une hotte à flux laminaire.
- Placez jusqu’à trois lamelles en verre recouvertes de lysine côte à côte dans une boîte de Pétri de 35 mm.
note: Pressez-les doucement contre le fond du plat pour éviter qu’ils ne glissent les uns sur les autres.
- Ensemencez 1,5 x 10cellules de 5 HEK (cellules rénales embryonnaires humaines) dans un milieu standard de 2 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) dans chaque plat.
- Complétez all-trans retinal à une concentration finale de 1 μM. Cultivez les cellules pendant au moins une journée avant de passer à l’étape 1.6.
- Transfecter transitoirement les cellules par lipofection.
- Pour chaque boîte de cellules, préparez une solution de 2 μg d’ADN plasmidique (acide désoxyribonucléique) dans 250 μL de DMEM sans FBS et 6 μL de réactif de transfection.
- Après 15 min d’incubation, ajoutez doucement (goutte à goutte) la solution dans les cellules.
- Préparer les ponts en gélose
- Ajouter 0,75 g d’agarose à 50 mL de solution stérile de chlorure de sodium (140 mM) et la dissoudre en la chauffant au micro-ondes.
REMARQUE : 2 à 3 M de KCl pour la préparation du pont de gélose réduisent davantage la LJP en raison d’une concentration plus élevée (par exemple, une diffusion constante du pont) et d’une mobilité égale des ions K+ et Cl-, mais a été évité pour minimiser les fuites d’ions (en particulier de Cl-) dans la solution du bain.
- Remplissez des pointes de pipette de 10 μL (ou un tuyau de petit diamètre) avec la solution d’agarose liquide à l’aide d’une seringue.
note: Évitez les bulles d’air dans le pont.
- Une fois les ponts de gélose refroidis et solidifiés, stockez-les dans une solution stérile de chlorure de sodium de 140 mM.
- Préparez les électrodes d’enregistrement et de bain.
- Retirez les fils d’argent du bain et de l’électrode d’enregistrement de la configuration patch-clamp.
- Polissez les fils avec du papier de verre pour enlever le chlorure d’argent des expériences précédentes. Immergez le fil d’argent propre dans 3 M de KCl et connectez-le au pôle positif d’une pile de 1,5 V pour un revêtement électrolytique au chlorure d’argent.
REMARQUE : Une alimentation de laboratoire peut être utilisée à la place d’une batterie.
- Tirez des pipettes patch à faible résistance (1,5-3,0 MΩ) des capillaires en verre à l’aide d’un extracteur de micropipettes et polissez-les au feu. Rangez les pipettes à l’abri de la poussière le jour de la mesure.
- Allumez tous les composants de la configuration pour qu’ils atteignent la température de fonctionnement 30 minutes avant les enregistrements. Assurez-vous que les tampons sont à température ambiante.
2. Mesures de sélectivité
- Démarrer les enregistrements 24 à 48 h après la transfection transitoire des cellules.
- Placez une lamelle dans la chambre de mesure et scellez-la avec du silicone pour éviter les fuites du tampon externe. Conservez la boîte de Pétri avec les autres lamelles dans un incubateur pour la prochaine série d’expériences.
- Remplissez soigneusement la chambre avec un tampon extracellulaire (élevé [Cl-]) pour éviter le détachement des cellules, puis placez-la sous le microscope et utilisez l’objectif 40X pour visualiser les cellules.
- Placez un pont en gélose sur l’électrode du bain et placez-le dans la chambre avec le capteur de niveau de liquide et la sortie de perfusion du manipulateur de bain.
- Remplacez la solution extracellulaire deux fois par 1 mL de solution externe fraîche (élevée [Cl-]) pour éliminer le milieu de culture résiduel et les cellules détachées.
- Faites la mise au point sur les cellules et recherchez une cellule transfectée (fluorescente), qui doit être isolée des autres cellules. Utilisez un ensemble de filtres à trois bandes et une lumière orange (590 nm ; bande passante 15 nm ; intensité de 100 %) pour exciter et visualiser mCherry.
note: Les cellules HEK peuvent être couplées électriquement à leurs voisines par des jonctions lacunaires, ce qui permet d’obtenir une faible résistance membranaire dans la configuration de la cellule entière.
- Remplissez l’une des pipettes tirées avec une solution intracellulaire et éliminez les bulles d’air en retournant la pipette plusieurs fois.
- Montez la pipette sur le support de pipette et appliquez une pression positive pour éviter l’obstruction de la pointe.
- Localisez l’extrémité de la pipette patch sous le microscope et faites-la naviguer près de la cellule à l’aide du micromanipulateur.
note: Les étapes suivantes s’appliquent à l’amplificateur, aux logiciels d’acquisition de données et d’évaluation mentionnés dans la liste des matériaux.
- Démarrez le « test membranaire » dans le logiciel d’acquisition de données et appliquez un pas de tension (impulsion de test ; par exemple 5 mV pendant 10 ms, ligne de base à 0 mV), manuellement ou automatiquement via le logiciel spécifié en utilisant le « mode bain » lors de l’exécution du « test de membrane » dans le logiciel d’acquisition de données.
- Vérifiez que la résistance de la pipette se situe dans la plage souhaitée (1,5-3,0 MΩ).
- Courants de décalage zéro en ajustant le potentiel de la pipette en tournant le bouton de décalage de la pipette sur l’amplificateur tout en travaillant en « mode bain » du « test à membrane ».
- Établissez un correctif dans la configuration de la cellule entière.
REMARQUE : Les étapes suivantes nécessitent l’application d’une pression positive et négative délivrée à l’orifice latéral du porte-pipette utilisé. Cela peut se faire à l’aide d’une seringue, d’un embout buccal ou d’un régulateur de pression à commande électronique. Dans ce protocole, une pression positive et négative est appliquée via un embout buccal.
- Approchez-vous lentement de la cellule avec la pipette patch par le haut et relâchez la pression positive juste avant de la toucher.
REMARQUE : Lorsque la pointe est proche de la cellule, la résistance augmentera légèrement ; Ceci est indiqué par une taille réduite de l’impulsion de test.
- Changer le « test membranaire » du « mode bain » au « mode patch », donc le potentiel de maintien au potentiel de repos attendu des cellules (-30 à -40 mV).
- Dans certains cas, la configuration attachée à la cellule se forme après le relâchement de la pression positive. Si ce n’est pas le cas, appliquez doucement une pression négative pour faciliter la formation du gigaseal.
note: La configuration attachée à une cellule est établie lorsque l’impulsion de test est réduite à deux petits pics capacitifs au début et à la fin de l’impulsion et que la résistance de la membrane est dans la gamme GΩ ; des tensions négatives allant jusqu’à -60 mV peuvent faciliter la formation de gigaseal.
- Compensez la capacité de la pipette en tournant les boutons « Compensation de capacité de la pipette » pour obtenir une réponse plate de l’impulsion de test.
- Rompre le patch sans détruire l’étanchéité en appliquant de courtes impulsions de pression négative ou de pression négative avec une force croissante, pour obtenir une conformation de cellule entière.
note: La réussite de la transition de la configuration attachée à la cellule entière est indiquée par une augmentation des pics capacitifs.
- Appliquez une compensation de résistance en série en réglant les paramètres de la cellule entière et des ajustements de compensation de l’amplificateur utilisé pour un serrage précis du potentiel de membrane à la tension de maintien souhaitée.
- Basculez le mode « test de membrane » en mode « cellule entière », dans le panneau « Compensation de résistance en série », activez « prédiction » et « correction » jusqu’à 90 % en évitant les dépassements et l’oscillation de la réponse capacitive, allumez l’interrupteur de compensation de cellule entière et ajustez les paramètres de la cellule entière avec les boutons appropriés du panneau avant (« capacité de cellule entière » et « résistance en série ») de l’amplificateur de manière itérative pour obtenir idéalement réponse du joint d’essai plat.
note: Pour une description détaillée de la compensation et de la correction de la résistance en série, reportez-vous au manuel ou aux directives de l’amplificateur, car cette procédure varie selon les fabricants.
- Après avoir établi la configuration de la cellule entière, attendez au moins 2 minutes avant l’enregistrement pour assurer un remplacement suffisant de la solution intracellulaire à l’aide de la pipette patch.
- Enregistrez les courants induits par la lumière à différents potentiels de maintien en utilisant les protocoles précédemment configurés (en 1.2).
- Remplacer le tampon extracellulaire à faible teneur en [Cl-] dans la chambre au moins cinq fois sans détruire le patch et enregistrer une autre relation courant-tension (cf. étape 1.2) à la nouvelle concentration de chlorure.
note: Un système de perfusion pour l’échange automatique de tampon facilite ce processus mais n’est pas nécessaire.
- Répétez l’opération 2.15. pour chaque condition ionique à tester, mais vérifiez à plusieurs reprises la qualité du patch entre les mesures par un « test membranaire » décrit ci-dessus.
note: Pour garantir une tension membranaire précise et une composition ionique intracellulaire stable, la résistance membranaire doit être supérieure à 500 MΩ, tandis que la résistance d’accès ne doit pas dépasser 10 MΩ, voir 2.12.6). N’oubliez pas de désactiver la compensation des paramètres de la cellule entière pour le test à membrane.
- Répéter les exercices 2.2 à 2.15 pour plusieurs cellules, mais prendre un nouveau bordereau de recouvrement pour chaque série de tests afin de s’assurer de la salubrité des cellules.
Tableau 1 : Composition ionique des solutions tamponnées. Composition de tampons intracellulaires (intra.) et extracellulaires (extra.) pour des expériences de sélectivité des chlorures dans des cellules HEK. Abréviations utilisées : acide éthylène glycol tétraacétique (EGTA), acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthananesulfonique (HEPES) et aspartate (ASP). Toutes les concentrations sont exprimées en mM.
| intra. | Extra.1 | Extra.2 |
| Teneur élevée en chlorure | Faible teneur en chlorure | Faible teneur en chlorure |
| c [mM] | c [mM] | c [mM] |
| Na-ASP | 0 | 0 | 140 |
| NaCl | 110 | 140 | 0 |
| Kcl | 1 | 1 | 1 |
| CsCl | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | deux | deux | deux |
| MgCl2 | deux | deux | deux |
| HEPES | 10 | 10 | 10 |
| EGTA | 10 | 0 | 0 |
| pH | 7.2 | 7.2 | 7.2 |
| osmolarité | 290 mOsm | 320 mOsm | 320 mOsm |
