1. Enregistrement
REMARQUE : Dans cette procédure, les enregistrements par patch clamp du ganglion isolé sont généralement effectués 12 à 24 h après le placage. D’autres laboratoires ont rapporté des résultats de neurones après des périodes de culture beaucoup plus longues.
- Préparer la chambre d’enregistrement
- Utilisez la chambre d’enregistrement à échange rapide (ou équivalent) qui permet d’effectuer des enregistrements par patch-clamp directement dans la boîte de culture. Installez la chambre sur le microscope inversé.
- Insérez les plats de culture à fond de verre dans la chambre.
- Introduire la solution de L-15 dans la chambre d’enregistrement à travers un système de tubulure de perfusion. Stabiliser l’entrée et la sortie de la perfusion dans la chambre à un débit de 0,5 à 1 mL par minute.
- Préparer la solution interne pour le chargement des électrodes
- Décongeler une partie aliquote de la solution interne perforée. Répartir 2,5 mL de la solution dans une boîte de culture de 35 mm. Remettez le couvercle sur le plat de culture et étiquetez-le comme « Tip Dip ». Réservez dans une zone à l’abri de la poussière, car il est très important de garder cette solution aussi propre que possible.
- Peser 1 mg d’amphotéricine B et ajouter 20 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO). Vortex et faites tourner la solution jusqu’à ce que toute l’amphotéricine-B soit dans la solution. Ajouter 10 μL de la solution de DMSO/amphotéricine B aux 2 mL restants de la solution interne perforée décongelée. Prélever et dissiper la solution à l’aide d’une pipette deux ou trois fois pour s’assurer que le DMSO/amphotéricine B s’est mélangé uniformément à la solution interne. La solution aura une légère teinte jaunâtre.
- Aspirer la solution interne perforée d’amphotéricine B dans une seringue de 3 ml. Ajoutez un embout de 34 G dans la seringue. Enveloppez la seringue dans du papier d’aluminium et maintenez-la sur de la glace.
note: Cette solution doit être refaite toutes les 2 h pour assurer l’efficacité de l’amphotéricine-B à perforer la membrane cellulaire. L’amphotéricine-B est sensible à la lumière et doit être protégée de la lumière à l’aide d’une feuille d’aluminium ou d’autres méthodes.
- Enregistrements patch-clamp
- Visualisez les neurones à l’aide d’un objectif 10x ou 20x. Ajustez l’éclairage et optimisez l’optique pour voir les limites et les ombres autour de la cellule.
- Vérifiez la qualité des neurones isolés. N’essayez que des neurones avec des surfaces lisses et régulières qui ne sont pas trop contrastées et n’ont que de petits cratères dispersés. Assurez-vous également d’éviter les paires de neurones, les neurones entourés de débris ou d’autres cellules.
- Sous un grossissement de 100x, identifiez un neurone ou un champ de neurones à patcher et alignez-les au centre du champ de vision.
- Remplissez l’extrémité de la pipette avec une solution propre qui ne contient pas d’amphotéricine en trempant l’extrémité (pendant ~20 s) dans la solution propre qui a été placée dans une boîte de culture. L’action capillaire aspirera une petite quantité de solution dans l’embout.
note: Effectuez cette étape sous un microscope à stéréodissection, ce qui permet de déterminer dans quelle mesure l’embout maintient la solution Tip Dip. Si la solution ne tient pas pendant ~10-20 s, la forme de l’électrode n’est pas idéale. Dans ce cas, reconfigurez le programme de tirage des électrodes pour produire une pointe plus longue.
- Ensuite, remplissez le dos de la pipette avec la solution interne contenant de l’amphotéricine. Le filament à l’intérieur de la pipette aspirera la solution pour rencontrer la solution propre dans la pointe. Laissez le filament tirer doucement la solution vers le bas et n’essayez pas de taper des bulles, car cela forcerait l’amphotéricine à se diriger trop rapidement vers la pointe.
- À l’aide d’une seringue, aspirez la solution qui se trouve peut-être tout à l’arrière de l’électrode.
note: Il est très important de travailler rapidement à partir de ce point pour atterrir et former un joint à haute résistance sur la cellule souhaitée.
- Insérez la pipette dans le support de pipette. Vérifiez que la pipette est bien ajustée dans le support pour éviter toute dérive de la pipette. Si la pipette n’est pas stable, remplacez les joints toriques d’étanchéité à l’avant et à l’arrière du porte-pipette pour minimiser la dérive et maintenir une forte aspiration. Remplacez la pipette par une pipette fraîchement remplie.
- Abaissez la pipette dans le bain de la chambre d’enregistrement.
- Placez la pointe de la pipette au milieu du champ de vision. Assurez-vous que la pointe est exempte de bulles d’air ou d’autres débris.
- Appliquez un pas de tension (5 mV) dans le test à membrane pour surveiller la résistance de la pipette. Continuez à surveiller la résistance d’entrée tout au long du processus de formation d’un joint sur la cellule.
- Annulez le potentiel de décalage de la pipette, de sorte que le courant de la pipette indique zéro dans le mode de test sur membrane de pClamp.
- Corrigez la capacité de la pipette à l’aide de la fonction de compensation de capacité rapide de l’amplificateur patch-clamp (cadrans rapides Cp dans l’écran logiciel Multiclamp Commander).
- Déplacez la pipette vers le bas jusqu’à la cellule.
- Une fois que la pipette est suffisamment proche du neurone, passez à l’objectif à fort grossissement et envoyez l’image via une caméra à un moniteur (utilisez un objectif 40x, un grossissement total 400x). Ajustez la pipette et recentrez le neurone.
- Déplacez l’électrode d’enregistrement près du soma. Localisez le centre du neurone sur le moniteur et positionnez l’électrode d’enregistrement au-dessus du neurone.
- Approchez-vous du neurone par le haut, de sorte que l’électrode atterrisse au centre de la cellule sphérique. Ajustez le décalage de la pipette à zéro sur les potentiels CC constants dans le système.
- Positionnez la pipette près de la membrane. Atterrir fermement au centre de la cell.
note: Lors de l’atterrissage, un petit fossette à la surface du neurone et un doublement/triplement de la résistance d’entrée se produiront.
- Appliquez une pression négative (aspiration) à l’aide d’une seringue ou d’une pipette buccale. Activez le potentiel de maintien de -60 mV. La résistance du joint doit augmenter jusqu’à ce qu’il dépasse un giga-ohm.
note: Travaillez rapidement pour réduire le temps entre le remplissage d’une électrode et l’atterrissage sur une cellule. Il y a un temps limité avant que l’amphotéricine ajoutée à la solution interne perforée atteigne l’extrémité de l’électrode. Une fois que la pointe est contaminée par l’amphotéricine, il est difficile de former des joints à haute résistance, et la résistance plafonne souvent à ~200 mégaohms.
- Une fois qu’un joint giga-ohm se forme, relâchez la pression négative. Dès que le joint se forme, appliquez une compensation de capacité rapide pour réduire autant que possible l’amplitude des transitoires de capacité de la pipette en mode de test sur membrane.
- Au fur et à mesure que l’amphotéricine commence à agir, observez que la résistance d’entrée diminue lentement et que le courant circulant en réponse au pas de tension de 5 mV augmente progressivement à mesure que l’amphotéricine pénètre dans la membrane. Une diminution soudaine de la résistance en série au lieu d’une stabilisation progressive suggère qu’une rupture spontanée s’est produite.
- Estimez la capacité de la cellule entière et la résistance série à l'aide de la fonction d'annulation transitoire capacitive de l'amplificateur. Documentez et surveillez la résistance en série au début et régulièrement pendant l’expérience.
note: La résistance en série peut prendre de 5 à 20 minutes pour se stabiliser, en fonction de la taille de l’électrode et de la quantité de solution propre aspirée dans la pipette. Les modes de pince de tension et de courant peuvent être utilisés une fois que la résistance série s’est stabilisée en dessous de 30 mégaohms. Un gonflement ou un rétrécissement des neurones pendant l’enregistrement est parfois observé, mais rarement lorsque l’osmolarité et le pH des solutions sont correctement ajustés.
