Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Enregistrement par patch-clamp apparié et remplissage de biocytine
Selon le type de connexion synaptique, trois approches différentes sont utilisées pour trouver des neurones couplés synaptiquement. Si la probabilité de connexion est faible (comme on peut s’y attendre pour la plupart des connexions excitatrices), procédez comme suit :
- Connexions neuronales à faible connectivité
- Remplissez les pipettes patch avec une solution interne de la composition indiquée dans le tableau 1. Pour tous les enregistrements dans la configuration de cellules entières, ajoutez de la biocytine à des concentrations comprises entre 3 et 5 mg/ml dans la solution interne (pipette) pour obtenir de bons résultats de coloration pour les neurones pré- et postsynaptiques. Laissez la biocytine diffuser dans la cellule pendant au moins 15 à 30 minutes (selon la taille du neurone).
REMARQUE : N'ajoutez pas de biocytine à la solution utilisée dans les pipettes de recherche mentionnées ci-dessous.
- Patchez un neurone postsynaptique putatif en mode cellule entière. Utilisez des pipettes patch à tige longue et fine. Cela facilite la maniabilité de la pipette sous l’objectif et réduit les artefacts de mouvement qui peuvent se produire lorsque l’électrode est introduite dans la tranche.
- Ensuite, patchez un neurone présynaptique potentiel dans une configuration attachée à une cellule à l'aide d'une pipette patch « de recherche » d'une résistance de 8 à 10 MΩ et d'un petit diamètre de pointe. Ces pipettes établissent un patch « lâche » attaché aux cellules. Remplissez la pipette « de recherche » avec une solution interne dans laquelle K+ est remplacé par Na+ (Tableau 2) pour empêcher les neurones de se dépolariser lors de la recherche d'une cellule présynaptique.
REMARQUE : La résistance du joint « lâche » n'est pas dans la plage GΩ mais généralement autour de 30 - 300 MΩ.
- Maintenez le potentiel de membrane sous le joint « lâche » à environ -30 à -60 mV en mode de pince de courant. Ensuite, appliquez de grandes impulsions de courant (0,2 - 2 nA) pour provoquer un potentiel d’action dans la cellule présynaptique potentielle. Observez ce potentiel d’action comme un petit épilet sur la réponse en tension.
- Réglez la fréquence de stimulation sur 0,1 Hz pour éviter une réduction de la réponse postsynaptique. Utilisez des fréquences de stimulation plus basses si le tissu cérébral est très immature ou si la connexion synaptique n’est pas très fiable.
- Dans le cas où le neurone « postsynaptique » ne répond pas à la stimulation du neurone « présynaptique » testé, patchez un nouveau neurone en mode de sceau « lâche ». Ne remplacez pas l'électrode patch « de recherche » tant que le joint avec une résistance de >30 MΩ est établi. De cette façon, testez jusqu’à 30 neurones potentiellement présynaptiques.
note: Pour éviter d’endommager le neurone pendant la procédure de recherche avec une pince à patch lâche, seule une légère aspiration doit être appliquée à la pipette de recherche par rapport à celle appliquée à la pipette patch à cellules entières.
- Si la stimulation en mode d'étanchéité « lâche » entraîne un EPSP/IPSP (potentiel postsynaptique excitateur/potentiel postsynaptique inhibiteur) avec une latence de <5 ms dans le neurone postsynaptique, retirez la pipette « de recherche » du neurone présynaptique.
- Remplacez la pipette patch « de recherche » par une électrode patch remplie d'une solution interne régulière contenant de la biocytine. Assurez-vous que cette pipette patch d’enregistrement a une résistance de 4 à 8 MΩ ; Plus la taille du soma est grande, plus la résistance de l’électrode peut être faible.
- Patchez le neurone présynaptique et enregistrez-le en mode de pince de courant sur cellule entière. Susciter des potentiels d’action par injection de courant dans les neurones présynaptiques et enregistrer la réponse postsynaptique. Stockez les données sur un ordinateur pour une analyse ultérieure hors ligne.
Table 1. Solution de pipette à faible teneur en chlorure.
| mm | g/L | g/50 ml |
| K-gluconate | 135 | 31.622 | 1,5811 |
| Kcl | 4 | 0,298 | 0,0149 |
| HEPES | 10 | 2,384 | 0,1192 |
| Phosphocréatine | 10 | 2,552 | 0,1276 |
| ATP-Mg2+ | 4 | 2.028 | 0,1014 |
| GTP-Na | 0,3 | 0,156 | 0,0078 |
| Ajuster le pH à 7,3 avec KOH |
| Osmolarité ~300 mOsmol/L |
| Ajouter 3 - 5 mg/ml de biocytine |
Tableau 2. Solution de pipette à haute teneur en Na pour la recherche de neurones couplés synaptiquement.
| mm | g/L | g/50 ml |
| Na-gluconate | 105 | 22,92 | 1,146 |
| NaCl | 30 | 1,76 | 0,088 |
| HEPES | 10 | 2,384 | 0,1192 |
| Phosphocréatine | 10 | 2,552 | 0,1276 |
| ATP-Mg2+ | 4 | 2.028 | 0,1014 |
| GTP-Na | 0,3 | 0,156 | 0,0078 |
| Ajuster le pH à 7,3 avec du NaOH |
| Osmolarité ~300 mOsmol/L |
