Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Enregistrements par patch clamp
- Placez la solution d’électrode (voir tableau 1) sur de la glace pour éviter toute dégradation. Remplissez la pipette patch en verre avec une solution intracellulaire filtrée (filtre de seringue, taille des pores : 0,2 μm) et placez la pipette dans le porte-pipette de l’étage de tête. Appliquez une légère pression positive sur la pipette à l’aide d’une seringue de 5 ml en déplaçant le piston d’environ 1 ml avant d’abaisser la pipette dans la solution du bain.
Remarque : Cela permet d’éviter que la pipette ne se bloque.
- Choisissez le mode « V-clamp » en tournant le bouton de mode de l’amplificateur, puis ouvrez l’interface « Test de membrane » dans le logiciel. Approchez la pipette du neurone cible lors d’une inspection au microscope.
note: Dans la préparation intacte de DRG, une fine couche de cellules gliales satellites encapsule chaque neurone.
- Utilisez la pression positive de la pipette pour traverser la couche de cellules gliales satellites jusqu’à ce qu’un élargissement soudain de l’espace entre le neurone et la couche environnante de cellules gliales satellites soit observé. Continuez à déplacer la pipette vers le neurone jusqu’à ce qu’une « fossette » soit observée sur le neurone.
note: Par rapport aux enregistrements de neurones dissociés, la pression positive doit être légèrement plus grande, ce qui aidera à pénétrer la couche de cellules gliales satellites et augmentera les chances de réussite du patching.
- Réduire la pression positive. Ensuite, obtenez une étanchéité giga ohm avec une aspiration douce.
note: Avec cette méthode, le taux de réussite de l’enregistrement est d’au moins 70 %.
- Obtenez la configuration de l’enregistrement de la cellule entière comme décrit précédemment.
- Pénètre brièvement la membrane cellulaire du neurone via une aspiration courte mais forte. Vous pouvez également utiliser la fonction « zap » de l'amplificateur pendant que l'aspiration est appliquée.
- Une fois qu’un mode de cellule entière est établi, compensez la capacité de la cellule entière et la résistance série (Rs) en tournant les boutons de compensation de capacité et de résistance de l’amplificateur.
note: Rs est normalement de 5 à 20 MΩ.
- Abandonnez la cellule si Rs est initialement supérieur à 30 MΩ ou s’il change de plus de 20 % pendant l’enregistrement. Mesurez également le potentiel de membrane au repos ; abandonner une cellule si celle-ci est supérieure à -50 mV.
- Fermez la fenêtre « Test de membrane ». Choisissez le mode « I-clamp normal » en tournant le bouton de mode de l’amplificateur.
- Cliquez sur « ouvrir le protocole » dans le logiciel, sélectionnez et chargez le protocole de mesure de la rheobase. Cliquez sur « enregistrer » pour démarrer l’enregistrement. Mesurez la résistance d’entrée et la rhéobase pour examiner l’excitabilité neuronale en injectant une série graduée de courants dépolarisants par pas de 100 pA.
- Cliquez sur « ouvrir le protocole » dans le logiciel, sélectionnez et chargez le protocole de mesure de la rheobase. Cliquez sur « enregistrer » pour démarrer l’enregistrement. Mesurez la résistance d’entrée et la rhéobase pour examiner l’excitabilité neuronale en injectant une série graduée de courants dépolarisants par pas de 100 pA.
- Utilisez un logiciel d'acquisition et d'analyse de données (par exemple, Clampfit) pour analyser les traces enregistrées selon les instructions du fabricant. Le logiciel calcule la résistance d’entrée (Rin) en fonction de la relation I-V à l’état stationnaire pendant les courants hyperpolarisants délivrés. Déplacez le curseur pour mesurer la valeur de la rhéobase et du seuil de membrane. note: L’amplitude de courant nécessaire pour induire le PA est définie comme la rhéobase, et la tension la plus basse pour induire le PA est définie comme le seuil de membrane.
- Enregistrer les courants induits par le ligand.
- Remplissez une pipette avec les agonistes spécifiques.
Remarque : Dans le présent rapport, nous avons utilisé 100 μM de glutamate et 100 μM AITC pour induire les courants médiés par les récepteurs du glutamate et les récepteurs TRPA1 respectivement.
- Vérifiez la pipette pour vous assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air à l’intérieur. Placez la pipette dans le porte-pipette. Connectez le porte-pipette à un tube connecté à un système de distribution de médicaments.
- Utilisez le manipulateur pour déplacer la pipette à moins de 50 μm du neurone. Réglez la pression du système de distribution du médicament sur 1 psi et la durée sur 1 seconde. Basculez le mode d’enregistrement sur la pince de tension et la pince à -70 mV. Appliquez brièvement la pression via le système de distribution du médicament pour enregistrer un courant induit par le médicament.
Table 1
| 100 ml de solution intracellulaire |
| Concentration (mM) | composant | Mw | L |
| 130 | KGluconate | 234,24 | |
| 10 | Kcl | 74,55 | |
| 10 | HEPES | 238,3 | |
| 10 | EGTA | | |
| deux | MgCl2 * 6H2O | 203,3 | |
| Remarques : Ajuster le pH à 7,4 avec du KOH et l’osmolarité à 260 - 280 mOsm avec du saccharose et de l’eau distillée. Ajouter 2 mM de MgATP, 0,5 mM de Na2GTP et filtrer avant utilisation immédiate. |
