Évaluation des synapses en ruban dans des régions de fréquence spécifiques de la cochlée de souris

Résumé

Source : Yu, S., et al. Évaluation morphologique et fonctionnelle des synapses en ruban dans des régions de fréquence spécifiques de la cochlée de la souris. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo présente une méthode d’évaluation des synapses de ruban dans des régions spécifiques de la cochlée de souris. Il utilise des techniques d’immunomarquage et d’imagerie confocale pour identifier les synapses fonctionnelles dans différentes régions de fréquence à chaque tour cochléaire.

Protocole

Toutes les procédures impliquant la manipulation d'animaux ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

1. Sélection des animaux

1. Pour toutes les expériences, utilisez des souris mâles adultes C57BL/6J (âgées de 8 semaines) comme modèle animal.
   REMARQUE : Les souris C57BL/6J portant une variante d’épissage du Cdh23 présentent une sénescence accélérée dans le système auditif, se traduisant par une perte de 40 % des synapses du ruban au niveau de la tour basal de la cochlée et une perte de 10 % au tour moyen à l’âge de 6 mois, suivie d’une augmentation rapide de cette perte dans l’ensemble de la cochlée avec l’âge. Par conséquent, nous vous conseillons de faire preuve de prudence lors de l’utilisation de souris C57BL/6J âgées de plus de 6 mois pour la recherche auditive. D’autres souches de souris peuvent être utilisées en fonction d’objectifs expérimentaux spécifiques.
2. Inspectez les souris à l’aide d’un otoscope de poche diagnostique professionnel pour exclure les pathologies de l’oreille externe ou moyenne avant les évaluations auditives. Les signes potentiels peuvent inclure du liquide ou du pus dans le conduit auditif externe, une rougeur et un gonflement des tissus locaux et une perforation de la membrane tympanique.
   REMARQUE : Bien que cela soit rarement rencontré, une fois identifié, les souris atteintes de maladies de l’oreille externe ou moyenne doivent être exclues.

2. Évaluation de l’audition

1. Anesthésier les souris à l’aide d’une injection intrapéritonéale d’un mélange de chlorhydrate de kétamine (100 mg/kg) et de chlorhydrate de xylazine (10 mg/kg). Jugez de la profondeur de l’anesthésie à l’aide de stimuli douloureux (par exemple, réflexe de pincement des orteils).
   REMARQUE : Lorsque le réflexe de pincement des orteils est complètement absent, l’animal a atteint une profondeur d’anesthésie adéquate pour les tests auditifs. Si plus de temps est nécessaire pour les enregistrements bilatéraux ABR (réponse auditive du tronc cérébral), administrez une dose plus faible (un cinquième de la dose initiale) d’anesthésiques pour restaurer le plan anesthésique d’origine. Veillez à éviter une surdose d’anesthésique, car cela peut entraîner la mort chez la souris.
2. Maintenez la température corporelle de l'animal anesthésié à 37,5 °C à l'aide d'un coussin chauffant thermorégulateur. Placez l’animal anesthésié dans une pièce protégée par des écrans électriques et acoustiques pour éviter les interférences tout au long du test auditif.
   REMARQUE : Maintenez la température physiologique pendant toute la procédure jusqu’à ce que l’animal soit totalement éveillé afin d’éviter la mort causée par l’hypothermie post-anesthésie.
3. Placez des électrodes aiguilleuses sous-cutanées (20 mm, 28 G) au sommet du crâne (électrode enregistreuse), dans la région parotidienne ipsilatérale sous le pavillon de l’oreille mesurée (électrode de référence) et dans la région parotide controlatérale (électrode de terre), avec une profondeur de 3 mm sous la peau de la tête de souris, respectivement.
4. À l’aide d’un haut-parleur à champ fermé, effectuez une stimulation acoustique à l’aide d’un tube en plastique de 2 cm avec une pointe en forme de cône. Insérez l’embout dans le conduit auditif externe.
   REMARQUE : Assurez-vous que l’impédance électrique dans les électrodes d’enregistrement et de référence est inférieure à 3 kOhm (généralement 1 kOhm). Si l’impédance est élevée, changez le site d’insertion de l’électrode, nettoyez l’électrode avec de l’alcool ou remplacez l’électrode pour éviter les altérations de l’amplitude de l’onde ABR.
5. Pour l’enregistrement ABR, générez des points de tonalité (durée de 3 ms, temps de montée/descente de 1 ms, à une fréquence de 21,1/s, fréquence : 4-48 kHz) et présentez-les à des niveaux de pression acoustique (SPL) décroissants de 90 à 10 dB par pas de 5 à 10 dB SPL. Au cours de cette étape, les réponses sont amplifiées (10 000 fois), filtrées (0,1 à 3 kHz) et moyennées (1 024 échantillons/niveau de stimulus).
   REMARQUE : Les ABR sont collectés pour chaque niveau de stimulus par pas de 10 dB, avec des pas supplémentaires de 5 dB près du seuil.
6. À chaque fréquence, déterminez le seuil ABR, qui fait référence au SPL minimal résultant en un enregistrement ABR fiable avec une ou plusieurs ondes distinctes qui peuvent être clairement identifiées par inspection visuelle.
   REMARQUE : Il est généralement nécessaire de répéter le processus pour des niveaux de pression acoustique faibles autour du seuil afin d’assurer la cohérence des formes d’onde. Le seuil de réponse est le niveau de stimulus le plus bas auquel la forme d’onde peut être observée lorsqu’une diminution de 5 dB entraînerait la disparition de la forme d’onde.

3. Traitement du tissu cochléaire

1. Après l’enregistrement ABR, euthanasiez les souris anesthésiées par luxation cervicale, décapitez-les, exposez la bulle du côté ventral et ouvrez-les avec des ciseaux tranchants pour accéder à la cochlée.
2. À l’aide d’une pince fine, retirez les os temporaux, sectionnez l’artère de l’étrier, retirez l’étrier de la fenêtre ovale et rompez la membrane de la fenêtre ronde. Faites un petit trou à l’apex de la cochlée en tournant doucement la pointe d’une aiguille (13 mm, 27 G).
3. Fixez les os isolés avec du paraformaldéhyde à 4 % (en poids/vol) dans une solution saline tamponnée au phosphate 0,1 M (PBS, pH 7,4) pendant une nuit à 4 °C. À l’aide d’une pipette à pointe fine, rincez doucement le fixateur à travers les espaces périlymphatiques en l’appliquant sur les fenêtres ovales ou rondes (comme entrée) et l’ouverture au sommet (comme sortie).
   REMARQUE : Certaines protéines nécessitent une courte durée de fixation pour éviter la destruction de leurs épitopes pour l’immunomarquage. Dans de tels cas, incuber les os dans du paraformaldéhyde à 4 % à température ambiante (RT) pendant 2 h, selon les instructions du fabricant pour l’immunohistochimie. La fixation peut également être réalisée par perfusion cardiaque pour éliminer le sang cochléaire, évitant ainsi le bruit de fond dû à une coloration non spécifique à des stades ultérieurs, en particulier dans les modèles murins de synaptopathie cochléaire.
4. Rincer les os trois fois pendant 5 minutes avec 0,1 M de PBS froid pour éliminer le paraformaldéhyde résiduel. Détartrer les os avec de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 10 % soit à RT pendant 4 h, soit à 4 °C pendant 24 h en secouant doucement dans un agitateur horizontal à 20 tr/min. EDTA peut être actualisé à mi-chemin.
   REMARQUE : Les temps de détartrage sont soumis à la concentration d’EDTA et aux préférences des utilisateurs. Le tissu décalcifié doit conserver un certain degré de ténacité, ce qui facilite la manipulation des montures cochléaires entières isolantes aux étapes ultérieures. Les os temporaux peuvent être décalcifiés à 10 % d’EDTA avec rotation, ce qui permet aux chercheurs de quitter le laboratoire après des tests ABR et des expériences de fixation. Le temps de détartrage est flexible dans la plage de 20 à 30 h à 4 °C.
5. Transférez un os temporal décalcifié de l’EDTA à 0,1 M PBS. Utilisez les pinces Dumont #3 et #5 et l’aiguille 27 G pour disséquer tour à tour les régions cochléaires apicale, moyenne et basale, puis disséquez la cochlée de l’os sous un microscope à stéréodissection. Faites une série de petites incisions le long du ligament spiralé à l’aide d’une lame de rasoir et retirez la membrane tectoriale et la membrane de Reissner (Figure 1).
   REMARQUE : Tant que la cochlée disséquée est intacte, ce processus peut être modifié selon le protocole habituel de chaque opérateur.
6. Disséquez davantage l’épithélium auditif restant, y compris le limbe spiralé, en tours cochléaires individuels (apex, milieu et base avec région du crochet) pour des préparations de montage entier.
7. Sous un objectif à huile 40x d’un microscope optique, mesurez la longueur de la membrane basilaire à l’aide d’une échelle de 250 μm placée dans l’oculaire, qui peut être ajustée le long des stéréocils des IHC.
8. Calculez la longueur de chaque tour cochléaire en additionnant toutes les longueurs de segment (250 μm par segment), et obtenez concomitamment la longueur totale de la membrane basilaire en additionnant les longueurs de chaque tour.
9. Convertissez la longueur totale de la membrane basilaire, y compris la région du crochet, en un pourcentage basé sur la distance à partir de l’apex cochléaire (0 % fait référence à l’apex cochléaire, 100 % à la base cochléaire).
10. Convertissez cette distance en fréquence caractéristique cochléaire à l’aide d’une fonction logarithmique (d( %) = 1 - 156,5 + 82,5 × log(f), avec une pente de fréquence de 1,25 mm/octave, où d est la distance normalisée par rapport à l’apex cochléaire en pourcentage, f est la fréquence en kHz), comme décrit précédemment. Ainsi, la gamme de fréquences dans une zone correspondante de la membrane basilaire à chaque tour cochléaire peut être acquise.

4. Coloration par immunofluorescence

1. Après la dissection, placez chaque tour cochléaire dans un tube à centrifuger séparé de 2,5 ml et incubez les tours cochléaires dans du sérum de chèvre à 10 % / PBS / Triton X-100 à 0,1 % pendant 1 h à RT sur un rotateur.
2. Retirer la solution de blocage/perméabilisation ci-dessus de chaque tube à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL sous un microscope de dissection et incuber les échantillons avec des anticorps primaires dilués dans 5 % de sérum de chèvre/PBS/0,1 % Triton X-100 pendant une nuit à 4 °C sur un rotateur.
   REMARQUE : Pour l’immunomarquage des rubans synaptiques cochléaires, utilisez le marqueur présynaptique de la protéine de liaison anti-carboxyl-terminale de souris 2 IgG1 (CtBP2, marquage du domaine B de la protéine d’échafaudage RIBEYE, 1:400) et le marqueur postsynaptique du récepteur anti-glutamate de souris 2 IgG2a (GluR2, marquage d’une sous-unité de l’acide α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique ou récepteur AMPA, 1:200).
3. Rincer trois fois pendant 5 minutes avec 0,1 M de PBS froid pour éliminer les anticorps primaires résiduels et incuber les échantillons avec des anticorps secondaires dilués dans 5 % de sérum de chèvre/PBS/0,1 % de Triton X-100 à RT pendant 2 à 3 h dans l’obscurité sur un rotateur.
   REMARQUE : Préparez des mélanges d’anticorps secondaires appropriés à l’aide d’Alexa Fluor 568 (IgG1, 1:500) et d’Alexa Fluor 488 (IgG2a, 1:500), qui sont complémentaires aux anticorps primaires utilisés à l’étape 4.2. Pour améliorer l’efficacité du marquage des rubans synaptiques, nous recommandons de sélectionner des anticorps secondaires spécifiques. Certains laboratoires prolongent l’incubation avec des anticorps secondaires pour augmenter l’immunomarquage de GluR2.
4. Rincer trois fois pendant 5 minutes avec du PBS 0,1 M pour éliminer les anticorps secondaires résiduels et transférer les échantillons des tubes à centrifuger de 2,5 ml sur des plaques de 35 mm contenant 0,1 M de PBS.
5. Placez une goutte de milieu de montage contenant du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) sur la lame et transférez les échantillons du PBS vers le milieu de montage. Placez le bord d’une lamelle sur la glissière et relâchez-la pour la laisser tomber doucement.
   REMARQUE : Pour s’assurer que les cellules ciliées sont orientées vers le haut et qu’aucun pliage ou torsion des échantillons cochléaires ne se produit pendant la procédure, montez les échantillons cochléaires sous un microscope à stéréodissection.
6. Placez les lames dans une boîte à lames à 4 °C pendant la nuit pour laisser sécher les lames, puis imagez sous un microscope confocal laser.

5. Évaluation morphologique des synapses du ruban cochléaire

1. Des diapositives d’images sont réalisées à l’aide d’un microscope confocal doté de trois lasers : une diode UV de 405 nm, un laser à argon de 488 nm et un laser à semi-conducteurs pompés par diode (DPSS) de 561 nm pour exciter le DAPI (spectre d’excitation de 409 à 464 nm), l’Alexa Fluor 488 (spectre d’excitation de 496 à 549 nm) et l’Alexa Fluor 568 (spectre d’excitation de 573 à 631 nm), respectivement.
2. Acquérez des piles z confocales sur une distance de 8 μm à partir de chaque tour cochléaire à l’aide d’un objectif à immersion dans l’huile haute résolution 63x.
   REMARQUE : Une fois définis, tous les paramètres de numérisation des photomicrographies doivent être enregistrés et appliqués uniformément à toutes les lames.
3. Pour le comptage des points synaptiques, réglez les piles z (taille de pas de 0,3 μm) pour couvrir toute la longueur des cellules ciliées internes (IHC), garantissant ainsi que tous les points synaptiques peuvent être imagés.
4. Fusionnez les images contenant des points dans une pile z pour obtenir la projection de l’axe z, et importez-les dans le logiciel de traitement d’images.
5. Divisez le nombre total de synaptiques dans chaque pile z à des régions de fréquence spécifiques par le nombre d’IHC (égal aux comptes manuels nucléaires DAPI) pour calculer le nombre de points synaptiques pour chaque IHC. À chaque région de fréquence spécifique, faire la moyenne de tous les points synaptiques dans trois images de différents champs microscopiques contenant 9 à 11 IHC.
   1. Décrivez les régions d’intérêt (ROI), y compris les régions basolatérales de chaque IHC à l’aide du bouton de sélection à main levée. Utilisez la fonction de mesure pour la quantification automatique des points de ponctuation et la fonction de bassin versant pour distinguer les points étroitement adjacents.
   2. Après chaque comptage automatisé, effectuez des inspections visuelles avec des corrections manuelles pour garantir la fiabilité du comptage ponctuel.
      REMARQUE : Les expérimentateurs doivent rester aveugles quant à savoir si la lame provient de l’apex, du milieu ou de la rotation basale de la cochlée.
6. Évaluez visuellement la structure et la distribution synaptiques pour isoler manuellement les IHC individuels de leurs voisins à l’aide de l’outil crayon (M) afin de mieux visualiser l’architecture cytosquelettique et la localisation synaptique.
7. Pour inspecter la juxtaposition de rubans présynaptiques (CtBP2) et de patchs de récepteurs postsynaptiques (GluR2), extrayez l’espace voxel autour du ruban à l’aide de l’outil de sélection rectangulaire et isolez le ruban individuel par recadrage. En cliquant sur Image > Taille de l’image, obtenez un tableau de vignettes de ces projections miniatures, qui peuvent ensuite être utilisées pour identifier les synapses appariées (apparues comme des paires étroitement juxtaposées de puncta CtBP2-positif et GluR2-positif) par rapport aux rubans orphelins (sans patchs de récepteurs du glutamate postsynaptiques) (Figure 2).
   REMARQUE : Les synapses cochléaires normales apparaissent sous la forme d’un immunomarquage combiné du ruban présynaptique dans la cellule ciliée (anti-CtBP2) et du patch du récepteur postsynaptique du glutamate sur la terminaison nerveuse auditive (anti-GluR2). Certains laboratoires utilisent des projections confocales en conjonction avec la modélisation 3D pour quantifier la taille ou le volume des patchs synaptiques. Avant une perte significative des synapses du ruban, les rubans présentant des changements de taille ou sans patchs appariés des récepteurs du glutamate sont probablement indicatifs d’un dysfonctionnement synaptique.

Résultats

Figure 1 : Localisation de la fréquence cochléaire chez la souris. (A) Une image représentative de la cochlée explantée complète, qui a été disséquée dans l’os temporal sous un microscope à stéréodissection. (B) La cochlée de la souris est divisée en tours apical, moyen et basal, où la paroi latérale cochléaire est retirée. Des cercles rouges ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chlorhydrate de kétamine	Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, Chine	H35020148	100 mg/kg
Chlorhydrate de xylazine	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	X-1251	10 mg/kg
Appareil de physiologie TDT	Tucker-Davis Technologies, Alachua, Floride, États-Unis	Système de physiologie auditive III
Logiciel SigGen/BioSig	Tucker-Davis Technologies, Alachua, Floride, États-Unis	Système de physiologie auditive III
Coussin électrique	Plaisir pour les animaux de compagnie	11072931136
Pince Dumont 3#	Fine Science Tools, North Vancouver, C.-B., Canada	Référence 0203-3-PO
Pince Dumont 5#	Fine Science Tools, North Vancouver, C.-B., Canada	Référence 0209-5-PO
Microscope à stéréodissection	Nikon Corp., Tokyo, Japon	SMZ1270
Sérum de chèvre	ZSGB-BIO, Pékin, Chine	ZLI-9021
Récepteur anti-glutamate 2, extracellulaire, clone 6C4	Millipore Corp., Billerica, MA, États-Unis	MAB397	souris
Souris purifiée Anti-CtBP2	BD Biosciences, Billerica, MA, États-Unis	612044	souris
Alexa Fluor 568 chèvre anti-souris IgG1anticorps	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, États-Unis	A21124	chèvre
Alexa Fluor 488 anticorps IgG2a de chèvre	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, États-Unis	N° A21131	chèvre
Support de montage contenant du DAPI	ZSGB-BIO, Pékin, Chine	ZLI-9557
Microscopie confocale à fluorescence	Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne	TCS SP8 II
Logiciel Image Pro Plus	Media Cybernetics, Bethesda, MD, États-Unis	Version 6.0
Otoscope de poche professionnel pour le diagnostic	Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai, Chine	HS-OT10
Électrode à aiguille	Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an, Chine	N° 1029	20 mm, 28 g
Haut-parleur à champ fermé	Tucker-Davis Technologies, Alachua, Floride, États-Unis	CF1