Évaluation des interactions entre les neurones glutamatergiques et les cellules de gliome dans une co-culture

Résumé

Source : Fuchs, Q. et. al., Co-culture de neurones glutamatergiques et de cellules de gliome pédiatrique de haut grade dans des dispositifs microfluidiques pour évaluer les interactions électriques. J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo démontre l’évaluation de l’activité électrique neuronale dans une co-culture de neurones glutamatergiques corticaux dérivés de hiPSC et de cellules de gliome à l’aide d’un dispositif microfluidique avec des réseaux de multiélectrodes.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

1. Protocole de co-culture

1. Ajustez le jour de l’ensemencement et la concentration pour les lignées cellulaires UW479 et BT35 afin d’atteindre 80 % des cellules confluentes lorsque la co-culture doit commencer, ce qui correspond à 21 jours de culture pour les neurones glutamatergiques.
2. Trypsiniser les cellules UW479 et BT35 et les ensemencer sur le dessus des neurones glutamatergiques dans chaque dispositif microfluidique dédié (avec une densité cible de 900 cellules/^mm2 pour chaque type de cellule) avant d’ensemencer les cellules de gliomes pédiatriques de haut grade (pHGG) dans le dispositif microfluidique contenant des neurones glutamatergiques matures.
3. Maintenir les co-cultures pendant 2 jours dans un environnement contrôlé (37 °C, 5 % CO₂) avec le neurone glutamatergique J11 et le milieu ultérieur détaillé dans le tableau 1.
4. Compter les cellules pHGG à l’aide des images microscopiques analysées avec un logiciel d’analyse d’images pour évaluer leur viabilité. Calculez le pourcentage de cells.
   REMARQUE : Utilisez la formule suivante : 100 - ((nombre de cellules à D23 / nombre de cellules à D21) x 100).

2. Enregistrement électrophysiologique

1. Effectuez l’enregistrement électrophysiologique à l’aide d’un système commercial et d’un logiciel disponible dans le commerce.
   note: Les expériences ont été réalisées avec un réseau de multiélectrodes (MEA) composé d’électrodes de 30 μm de diamètre espacées de 100 μm.
2. Réaliser un premier enregistrement électrophysiologique sur des neurones glutamatergiques à J21 avant l’ensemencement des cellules pHGG. Utilisez les neurones glutamatergiques différenciés comme contrôle et cultivez-les seuls en parallèle de la co-culture. Effectuez un deuxième enregistrement pour les deux conditions, comme décrit à l’étape suivante numérotée 3.
3. Réaliser un second enregistrement électrophysiologique à J23 (après 2 jours de co-culture).

Tableau 1 : Composition des milieux de culture pour les neurones glutamatergiques dérivés de hiPS.

Composants	Substrat de semis	D4 moyen	D7 moyen	D11 et suivants medium
DMEM/F-12 Moyen	0,5 fois	0,25x	0,125 fois	Ø
Milieu neurobasal	0,5 fois	0,25x	0,125 fois	Ø
BrainPhys Medium	Ø	0,5 fois	0,75 fois	1x
Supplément SM1	1x	1x	1x	1x
Supplément N2-A	1x	1x	1x	1x
Ala-Gln (GlutaMax)	0,5 million d’euros	0,5 million d’euros	0,5 million d’euros	0,5 million d’euros
Le BDNF	10 ng/mL	10 ng/mL	10 ng/mL	10 ng/mL
GDNF	10 ng/mL	10 ng/mL	10 ng/mL	10 ng/mL
TGF-β1	1 ng/mL	1 ng/mL	1 ng/mL	1 ng/mL
Geltrex	30 μg/mL	Ø	Ø	Ø
Supplément de semis	1x	Ø	Ø	Ø
Jour 4 Supplément	Ø	1x	Ø	Ø

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
256MEA100/30iR-ITO-w/o	Mcs	256MEA100/30iR-ITO-w/o
Sonde 40 μm pour compteur Scepter	Dutscher	Référence 53750
Sonde 60 μm pour compteur Scepter	Dutscher	Référence 51999
Ala -Gln (GlutaMAX)	sigma	G8541
Enceinte de sécurité biologique de classe II	Thermo Scientific	HERASafe type KS12
Neurones glutamatergiques corticaux	BrainXell (en	BX-0300
DMEM/F12 Moyen	sigma	D8437
DPBS 1X	Dutscher	L0615-500
Flacons de culture cellulaire EasYFlaskTM 75cm3	Nunc	156499
Sérum fœtal bovin (FBS)	Dutscher	500105
GDNF	Peprotech	450-10
Geltrex	Technologies de la vie	A1413201
BDNF humain	Peprotech	Référence 450-02
incubateur	Memmert	IC0150med
MEA2100	Mcs	181205-MEA2100-11240
Micropipette P10	Sartorius	LH-729020
Micropipette P100	Sartorius	LH-729050
Micropipette P1000	Sartorius	LH-729070
Micropipette P200	Sartorius	LH-729060
Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock	Dutscher	Référence 33290
Expérimentateur multicanal	Mcs	-
Supplément N2-A	Cellule souche	Référence 7152
Milieu neurobasal	Technologies de la vie	21103049
Supplément neuronal Neurocult SM1	Cellule souche	Référence 5711
Acides aminés non essentiels (NEAA) sans L-glutamine	Dutscher	Réf. X0557-100
Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity	Drummond	4000202/4038202
Pipette pour culture cellulaire 10 mL Falcon®	Dutscher	357551
Pipette pour culture cellulaire 5 mL Falcon®	Dutscher	357543
Plaque chauffante (CultureTemp)	Belart	370151000
Poly-D-lysine	sigma	P6407
Microscope Primovert	Zeiss	Tél. : 415510-1100-000

anglais)