Implantation d’un réseau d’électrodes et d’une fibre optique dans l’hippocampe de la souris

Abstract

Source : Bender, F., et. al., Entraînement optogénétique des oscillations thêta de l’hippocampe chez les souris en comportement. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo démontre l’implantation stéréotaxique d’un réseau d’électrodes et d’une fibre optique dans l’hippocampe d’un modèle murin.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation des fibres optiques (Figure 1A)

1. Utilisez une fibre optique multimode (noyau de 105 μm, recouvert de verre avec un noyau de silice, 0,22 NA). Dénudez la gaine de 125 μm du noyau de la fibre à l’aide d’un micro-décapant pendant que la fibre est toujours attachée à la bobine de fibre.
2. Coupez la fibre à une longueur d’environ 2-3 cm à l’aide d’un couteau diamanté.
3. Insérez la fibre dans une virole en céramique de zircone (ID : 126 μm). Environ 0,5 à 1 mm de la fibre optique doit dépasser du côté convexe de la virole.
4. À l’aide d’une aiguille, appliquez une goutte de colle époxy aux deux extrémités de la virole, mais pas sur les côtés de la virole. Vous pouvez également utiliser de la super colle.
5. Laissez la colle sécher pendant au moins 30 min.
6. Polir le côté convexe de la virole à l’aide d’un film de polissage de fibre de rodage diamanté (grain de 3 μm).
7. Testez la fidélité du transfert de lumière à l’aide d’un wattmètre optique.
   1. Réglez la longueur d’onde du wattmètre sur la même longueur d’onde que le laser utilisé.
   2. Positionnez le cordon de raccordement avec l’embout vers le centre du capteur. Allumez le laser et lisez la puissance lumineuse du wattmètre. Enregistrez la valeur.
   3. Connectez la fibre optique au cordon de raccordement via un manchon d’accouplement et positionnez-la avec la pointe de la fibre face au centre du capteur. Allumez le laser et lisez la puissance lumineuse du wattmètre. Enregistrez la valeur.
   4. Calculez le taux de transmission en divisant la deuxième valeur par la première valeur. Si le débit de transmission est inférieur à 0,5, jetez la fibre ; Sinon, utilisez-le pour l’implantation.
   5. Testez le taux de transmission de chaque fibre avant l’implantation.
   6. Pour des expériences ultérieures, ajustez l'intensité lumineuse du laser au taux de transmission de la fibre optique : réglez le rendement lumineux de l'extrémité du cordon de raccordement sur 5-15 divisé par le taux de transmission pour obtenir un rendement lumineux final de 5-15 mW à partir de la pointe de la fibre.

2. Préparation des réseaux de fils de tungstène pour les enregistrements LFP (Figure 1B)

1. Collez plusieurs guides de tube de silice de 100 μm (par exemple 6) en parallèle sur le côté collant d’un morceau de ruban adhésif. Coupez une seule pièce, d’environ 4 à 6 mm, pour un ensemble de fils.
2. Enfilez des fils de tungstène de 45 μm isolés par formvar à travers les tubes de guidage à l’aide d’une pince.
3. Dénudez six fils de liaison en cuivre fin isolés d’émail (environ 5 mm de long) et un fil de mise à la terre (d’environ 2 à 3 cm de long) à l’aide d’un scalpel pour gratter l’isolant aux deux extrémités. Soudez-les aux broches du nanoconnecteur.
4. Connectez chaque fil de liaison à un fil de tungstène à l’aide d’une goutte de peinture conductrice d’argent, respectivement. Laisser sécher au moins 30 min.
5. Appliquez un minimum de ciment pour couvrir les fils. N’appliquez pas de ciment sur les fils de tungstène, qui seront insérés dans le tissu cérébral, ou sur la partie supérieure du nano connecteur. Laissez sécher le ciment pendant au moins 30 minutes.
6. Effectuez une coupe angulaire (5-20°) des fils de tungstène à l’aide de ciseaux en acier inoxydable émoussés pour permettre une implantation fiable des fils en dessous ou au-dessus de la zone ventralement adjacente à la couche pyramidale, où l’amplitude thêta est trop faible pour estimer la fidélité de l’entraînement.
7. Désisolez l’extrémité (environ 2 mm) du fil de terre à l’aide d’un scalpel pour gratter l’isolant. Traitez-le avec du flux et de la pré-soudure.
8. Vérifiez les interactions potentielles entre les électrodes à l’aide d’un multimètre numérique. Connectez les broches du connecteur au multimètre, qui doit être réglé sur le mode de mesure de résistance. Vérifier les combinaisons de canaux par paires ; une lecture sur le multimètre inférieure à 5 MΩ indique une diaphonie significative.
9. Utilisez un impédancemètre pour vérifier l’impédance de chaque fil-électrode dans une solution saline. Les valeurs d’impédance typiques sont inférieures à 100 kΩ.
10. Pour faciliter l’implantation, collez une fibre optique sur le réseau de fils de sorte que la pointe de la fibre soit au niveau du fil le plus court et que la pointe de la fibre soit à proximité immédiate mais sans toucher les fils de tungstène. Gardez l’angle de la fibre aussi petit que possible afin d’éviter d’endommager les tissus lors de l’implantation.

3. Implantations stéréotaxiques

1. Retirez le tissu conjonctif du haut du crâne et enfoncez soigneusement les muscles du cou d’environ 2 mm pour éviter les artefacts musculaires pendant l’enregistrement.
2. Nettoyez le crâne à l’aide d’un applicateur à coton-tige et d’une solution saline, et percez quatre trous (2 à l’avant et deux au-dessus du cervelet, de 0,8 mm de diamètre) pour placer les vis en acier inoxydable de l’os (00-96x1/16) pour le sol et la stabilisation de l’implant (Figure 1D). Placez la vis de terre, reliée à un fil de cuivre (d’environ 2 à 3 cm de long) au-dessus du cervelet.
3. Couvrez complètement la vis de sol avec du ciment pour éviter les artefacts musculaires pendant les enregistrements électrophysiologiques. Construisez un anneau de ciment reliant toutes les vis (Figure 1E).
4. Réaliser une craniotomie au-dessus du côté implantaire (Hippocampe, AP-1.94, L 1.4, V 1.4 en référence au bregma). Appliquez environ 5 μL de NaCl stérile à la surface du tissu cérébral.
5. Abaissez lentement le réseau de fils à l’aide de la stéréotaxie dans la craniotomie. Pour les enregistrements unitaires, implantez une sonde en silicone au lieu d’un réseau de fils. Pour éviter les artefacts de lumière optoélectrique, implantez la fibre optique séparément dans l’hippocampe avec l’extrémité de la fibre ne faisant pas directement face à la sonde (Figure 1C-I). Pour l’étude de la coordination de l’entraînement entre les hémisphères, implantez une fibre optique supplémentaire dans la zone CA1 de l’hippocampe controlatéral.
6. Pour protéger les tissus cérébraux, appliquez environ 5 μL de cire liquide chaude/huile de paraffine, préchauffée à 70 °C, avec une seringue au-dessus du site d’implantation.
7. Appliquez du ciment autour du réseau de fils et recouvrez le crâne de ciment.
8. Appliquez une goutte de flux sur le fil de terre/de référence pré-soudé et le fil pré-soudé connecté à la vis de terre à l’aide, par exemple, d’une aiguille, et fusionnez les fils à l’aide d’une machine à souder.
9. Couvrez tout le fil de terre avec du ciment.
10. Administrer 0,3 mL d’Erycinum (1:4 dans du NaCl stérile) et de carprofène (5 mg/mL) i.p. après la chirurgie et pendant au moins les deux jours suivants. La souris se réveille généralement dans les 15 minutes suivant l’opération. Réchauffez l’animal avec une lampe rouge pour accélérer la récupération.
11. Surveillez le poids de la souris quotidiennement pendant la première semaine suivant la chirurgie ou jusqu'à ce qu'il soit stable. La perte de poids ne doit pas dépasser 10 % du poids enregistré de la souris avant la chirurgie. Pour accélérer la stabilisation du poids, fournissez à la souris de la nourriture humide et du lait concentré pendant les premiers jours suivant la chirurgie.
12. Pour enregistrer l’activité cellulaire de l’hippocampe pendant l’entraînement, implantez une sonde en silicone dans l’hippocampe (AP -1,94, L 1,4, V 1, avec abaissement ultérieur) (Figure 1C-I). Implanter la fibre optique dans l’hippocampe à AP-3, L 1.4, V 1.6, 39° caudal-rostral. Si la stimulation des somates cellulaires est souhaitée, implanter une fibre optique supplémentaire dans la MS (AP +0,98, L 1, V 3,9, 15° latéral).

Results

Figure 1 : Illustration des fibres optiques, des électrodes et de la chirurgie. (A) Illustration d’une fibre optique. (B) Illustration d’un réseau de fils collés à une fibre optique pour l’enregistrement de la LFP de l’hippocampe pendant l’entraînement des oscillations thêta de l’hippocampe. (C) Pour l’enregistrement de l’activité cellulaire d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Souris PV-Cre	Le Laboratoire Jackson	B6 ; 129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J
Stéréotaxie	David Kopf Instruments, Tujunga, Californie, États-Unis	Modèle 963	Instrument stéréotaxique ultra précis pour petits animaux
Mèches, 0,8 mm	Bijoutil, Allschwil, Suisse	49080HM
Station de soudage	Weller Tools GmbH, Besigheim, Allemagne	Journée mondiale de l’énergie 81
érythromycine	Rotexmedica GmbH, Trittau, Allemagne	PZN : 10823932	1g de poudre pour solution pour perfusion
Perceuse/meuleuse de précision	Proxxon, Wecker, Luxembourg	FBS 240/E
Fibre optique multimode	ThorLabs, Dachau, Allemagne	FG105LCA	0,22 NA, Low-OH, Ø105 μm Noyau, 400 - 2400 nm
Virole en céramique	Produits de fibres de précision, Milpitas, CA, États-Unis	CFLC126	Virole en céramique LC MM, ID 126um
Papier de polissage	Thorlabs	LF3D	Feuille de rodage (polissage) diamantée de 6 po x 6 po
Capteur de puissance	Thorlabs	PM100D	Console compacte de mesure de l’énergie et de l’énergie, écran LCD numérique 4"
Coupleur de fibre optique multimode	Thorlabs	FCMM50-50A-FC	Coupleur 1x2 mm, rapport de division 50:50, fibres GI 50 μm, FC/PC
Cordon de raccordement à fibre optique	Thorlabs	FG105LCA CUSTOM-MUC	sur mesure, 3 m de long, avec tube de protection, Tube : FT030, Connecteur 1 : FC/PC, Connecteur 2 : 1,25 mm (LC) Virole en céramique
manche	Produits de fibres de précision, Milpitas, CA, États-Unis	ADAL1	Manchon d’accouplement fendu en céramique pour embouts Ø1,25 mm (LC/PC)
Fils de tungstène	California Fine Wire Company, Grover Beach, Californie, États-Unis	CFW0010954	40 μm, 99,95 %
Tubulure capillaire	Optronique	1068150020	Diamètre intérieur : 100,4 μm
Nanoconnecteur d’Omnetics	Omnetics Connector Corporation, Minneapolis, États-Unis	Référence A79038-001
visses	Bilaney, Düsseldorf, Allemagne	00-96x1/16	en acier inoxydable
Peinture conductrice d’argent	Conrad electronics, Allemagne	530042
Flux liquide	Felder GMBH Löttechnik, Oberhausen, Allemagne	Lötöl ST	DIN EN 29454.1, 3.2.2.A (F-SW 11)