Contrôle optogénétique de la dynamique des réseaux de l’hippocampe

Résumé

Source : Manseau, F., et al. Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro : Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo montre la méthode d’utilisation de l’optogénétique pour moduler la dynamique du réseau hippocampique en activant des interneurones sensibles à la lumière génétiquement modifiés dans une tranche de cerveau de souris, en améliorant la synchronisation de l’oscillation thêta et en étudiant le comportement des circuits neuronaux.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Contrôle optogénétique dans l’hippocampe isolé
   REMARQUE : Pour le contrôle optogénétique de l’activité du réseau hippocampique, une stratégie spécifique au type de cellule impliquant l’activation rythmique des cellules GABAergiques contenant de la PV (parvalbumine-positive) est utilisée ici, car il a été démontré que ces cellules jouent un rôle majeur dans la synchronisation des populations de cellules principales dans l’hippocampe isolé. L’expression sélective de la channelrhodopsine-2 excitatrice (ChR2) dans les cellules PV est obtenue en croisant la lignée de souris PV-Cre avec des souris exprimant constitutivement ChR2 Cre-dépendante (Ai32), générant ainsi des souris PV-ChY. Alternativement, des constructions de vecteurs viraux (par exemple, AAVdj-ChETA-eYFP) peuvent être injectées dans l’hippocampe de souris PV-Cre ou PV-TOM (P15-16) pour piloter l’expression de l’opsine excitatrice dans les interneurones CA1/SUB (Figure 1A).
   1. Placez une électrode LFP dans la zone CA1/SUB (Cornu ammonis-1/subiculum) et patchez une cellule pyramidale voisine dans l’hippocampe isolé d’une souris exprimant l’opsine excitatrice sensible à la lumière bleue ChR2 dans les interneurones PV.
   2. Placez un guide de lumière à fibre optique (0,2 à 1 mm de diamètre) au-dessus de la préparation hippocampique et centrez-le sur la région enregistrée. Utilisez la lumière bleue (473 nm) d’une source LED pour la stimulation optogénétique, composée d’impulsions lumineuses (10 à 20 ms, déclenchées par un signal logique transistor-transistor) ou de commandes de tension d’onde sinusoïdale délivrées aux fréquences thêta (4 à 12 Hz).
   3. Passez à la pince de courant et caractérisez l’activité de la pyramidale lors des oscillations thêta spontanées.
   4. Démarrez le protocole de stimulation et enregistrez les réponses lumineuses. Observez que les oscillations de champ et l’activité synaptique dans le neurone enregistré deviennent de plus en plus synchronisées pendant la stimulation optogénétique et que la stimulation rythmique des cellules PV entraîne un contrôle robuste de la fréquence et de la puissance des oscillations thêta (Figure 1).

Résultats

Figure 1 : Potentiels de champ locaux et enregistrements simultanés de patch-clamps à partir de neurones pyramidaux et PV CA1/SUB uniques lors d’oscillations thêta spontanées et optogénétiques dans l’hippocampe isolé.

(a) Schéma montrant les sites d’enregistrement de la LFP et de l’électrode patch avec le placement du guide de fibre lumineuse au-des...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactifs
chlorure de sodium	Sigma Aldrich	Réf. S9625
saccharose	Sigma Aldrich	S9378
Bicarbonate de sodium	Sigma Aldrich	S5761
NaH2PO4 - phosphate monobasique de sodium	Sigma Aldrich	Réf. S8282
Sulfate de magnésium	Sigma Aldrich	Référence M7506
chlorure de potassium	Sigma Aldrich	Réf. P3911
D-(+)-glucose	Sigma Aldrich	G7528
Chlorure de calcium dihydraté	Sigma Aldrich	Réf. C5080
Ascorbate de sodium	Sigma Aldrich	A7631-25G
équipement
Mélange gazeux 95 % O2/5 % CO2 (carbogène)	Vitalaire	SG466204A	système de perfusion
Bouteilles/flacons en verre (4 x 1 L)	N.A.	N.A.	système de perfusion
Chambre d’enregistrement immergée	conception sur mesure (FM)	N.A.	Une alternative commerciale peut être utilisée
Amplificateur patch-clamp Multiclamp 700B	Dispositifs moléculaires	MULTICLAMP	électrophysiologie
Programme Multiclamp 700B Commander	Dispositifs moléculaires	MULTICLAMP	électrophysiologie
Convertisseur numérique/analogique	Dispositifs moléculaires	DDI440	électrophysiologie
Micromanipulateurs (à commande manuelle)	Siskiyou	MX130	électrophysiologie (LFP)
Micromanipulateurs (automatisés)	Siskiyou	MC1000e	électrophysiologie (patch)
Moniteur audio	Systèmes A-M	Modèle 3300	électrophysiologie
Microscope à fluorescence vertical sur mesure	Siskiyou	N.A.	imagerie
Caméra vidéo analogique	Le COHU	4912-2000/0000	imagerie
Carte d’acquisition d’images numérique avec logiciel d’imagerie	EPIX, Inc	PIXCI-SV7	imagerie
Objectif Olympus 2.5x	Olympe	MPLFLN	imagerie
Objectif d’immersion dans l’eau Olympus 40x	Olympe	UIS2 LUMPLFLN	imagerie
Système de diodes électroluminescentes (LED) sur mesure	coutume	N.A.	stimulation optogénétique (Amhilon et al., 2015)
animaux
Souris PV ::Cre (KI)	Laboratoire Jackson	Numéro de stock 008069	Permettre l’expression de gènes dirigés par Cre dans les interneurones PV
Souris Ai9 constitutive-conditionnelle (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI))	Laboratoire Jackson	Numéro de stock 007905	TdTomato express suite à une recombinaison médiée par Cre
souris Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP	Laboratoire Jackson	Numéro de stock 012569	Exprimer la protéine de fusion channelrhodopsine-2/EYFP améliorée après exposition à la Cre recombinase
Souris PVChY	Élevage en maison	N.A.	Progéniture obtenue par croisement de la lignée PV-Cre avec des souris Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP