Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Préparation du bioréacteur
- Fabriquer des moules de bioréacteur
- Téléchargez un fichier CAO (conception assistée par ordinateur) de bioréacteur à partir du fichier CAO supplémentaire ou créez une conception personnalisée.
- Générez un parcours d’outil CNC (Computer Numerical Control) à partir du modèle 3D à l’aide d’un logiciel de FAO (fabrication assistée par ordinateur).
- Usinez des moules en acétal à l’aide d’une fraiseuse CNC.
- Fabrication de bioréacteurs
- Mélanger une base 10:1 à un mélange d’agent de durcissement de polydiméthylsiloxane (PDMS, 77 g de mélange par 4 plates-formes/moules).
- Placez le mélange dans une chambre à vide, fermez toutes les vannes, allumez le vide et dégazez le mélange pendant au moins 30 minutes jusqu’à ce qu’il ne reste plus de bulles d’air. Versez le mélange dans des moules et dégazez les moules dans la chambre à vide pendant 1 h.
- Fermez les moules avec la moitié supérieure du moule dans le bon sens. Placez une tige hexagonale en acier au centre et clampez des deux côtés.
- Remplissez le haut avec du PDMS.
- Faites durcir les moules dans un four à 65 °C pendant au moins 4 h.
- Retirez les plates-formes des moules après refroidissement à température ambiante.
- Nettoyez les appareils dans un bain à ultrasons à l’aide de cycles de 1 h de savon à vaisselle, de 400 ml d’isopropanol à 100 % et d’eau distillée.
- Sécher une nuit à 65 °C.
- Faites tremper les lamelles de verre dans un polyol tensioactif non ionique à 1 % pendant 30 min, en veillant à ce qu’elles ne s’empilent pas afin qu’elles soient toutes correctement enrobées.
- Bien rincer à l’eau distillée et sécher une nuit à 65 °C.
- Traitez les lamelles en verre et la plate-forme PDMS avec un nettoyeur plasma à puissance élevée avec 6 L/min d’oxygène pendant 1 à 2 min. Une fois traités, collez les deux ensemble en appuyant sur le PDMS sur la lamelle pendant au moins 30 s.
- Autoclavez les dispositifs collés avant d’ajouter des cellules.
2. Construction d’une configuration de stimulation optique
- À l’aide d’un système de cube de cage de 30 mm, fixez un miroir dichroïque de 573 nm au centre. Associez une LED rouge de 627 nm (diode électroluminescente) à un filtre d’excitation passe-long de 594 nm et fixez-la sur la face supérieure du cube, la LED faisant face au miroir. Fixez ensuite une LED bleue de 488 nm avec un filtre d’excitation passe-court de 546 nm sur le côté adjacent du cube, avec la LED tournée vers le miroir, comme indiqué sur le schéma de la figure 1A.
- Fixez un diaphragme à iris actionné par anneau au bas du cube de cage pour contrôler la taille de la zone éclairée.
- Alimentez chaque LED avec un pilote de LED T-Cube et contrôlez-le via une carte Arduino Uno Rev3. Connectez l’entrée latérale du pilote LED à une prise de source d’alimentation, connectez la sortie centrale à l’Arduino et connectez la sortie latérale directement aux LED.
- Connectez l’Arduino Uno à un ordinateur à l’aide d’un câble USB.
- Téléchargez des fichiers à partir du lien GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
- Ouvrez le fichier « Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino » à partir du dossier GitHub.
- Définissez les paramètres de départ : Steps = 30 ; startFrequency = 0,5 ; endFrequency = 3 ; pulseLength = 100.
- Assurez-vous que la sortie de broche 4 est affectée au pilote de LED bleue et que la sortie de broche 2 est affectée au pilote de LED rouge. Vérifiez que les fils centraux du pilote de LED sont connectés à la terre et à la sortie de broche respective.
- Compilez et chargez le programme « Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino » sur Arduino.
- Connectez chaque pilote de LED à son canal correspondant.
3. Configuration de la culture cellulaire (jour -21-0)
- Cellules musculaires squelettiques primaires
- Décongeler et étendre les myoblastes squelettiques primaires (obtenus à partir de Cook Myosite) pour un maximum de six passages à l’aide d’un milieu de croissance myotonique (+ supplément). Maintenir les cellules dans un incubateur réglées à 37 °C et 5 % de CO2.
- Changez de support tous les 2 jours.
- Une fois que les cellules sont confluentes à environ 60 %, passez-les en utilisant 0,05 % de trypsine-EDTA (1x, pendant 5 min à 37 °C). Récupérez les cellules dissociées et ajoutez un milieu frais pour neutraliser la trypsine.
- Faites tourner les cellules à 300 x g et aspirez le surnageant au-dessus de la pastille cellulaire.
- Remettre les cellules en suspension avec du MGM et ensemencer 1:3 avec 60 mL par fiole à trois couches.
- ChR2-hiPSC
note: Toutes les lignées cellulaires de ce travail ont été créées et utilisées conformément aux directives institutionnelles de l’Université Columbia, NY, États-Unis. Dans ce protocole, les hiPSC exprimant ChR2 ont été générées via l’édition du génome CRISPR-Cas9 à l’aide des méthodes décrites précédemment18, mais toutes les lignées cellulaires optogénétiques stables (lentivirales, piggyBac, etc.) peuvent être utilisées de la même manière. Les promoteurs constitutifs exprimés à la fois dans les iPSC et les motoneurones ont été choisis (CAG). Les cellules présentaient des caryotypes sains, comme indiqué dans des publications précédentes.
- Enduire les plaques à 6 puits avec 1 mL/puits de matrice de membrane basale solubilisée diluée dans du DMEM/F12 (1:80) et incuber les plaques à température ambiante pendant 1 h.
- Semez les iPSC sur des plaques enrobées à 6 puits avec 2 mL de milieu de culture cellulaire sans nourricier (milieu iPSC), en échangeant 2 mL de milieu tous les deux jours et en passant tous les 5 à 7 jours. Maintenir les cellules dans un incubateur réglé à 37 °C et 5 % de CO2.
- Passage
- Dissociez les cellules souches en les incubant avec 1 mL de réactif de libération de cellules souches exemptes d’enzymes pendant 4 min et en les cisaillant mécaniquement avec une pipette P1000 à pointe large.
- Cellules de semence dans un rapport de 1:24 ou 1:48 dans un milieu iPSC avec 2 μM de dichlorhydrate d’Y-27632 dans 2 mL/puits sur des plaques enduites à 6 puits.
4. Ensemencement des tissus musculaires squelettiques (jour -3)
- Isolez et comptez 30 x 106 myoblastes à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.
- Remettre les myoblastes en suspension dans un mélange 4:1 de 3 mg/mL de collagène I et de matrice de membrane basale solubilisée (800 μL de mélange de collagène + 200 μL de matrice de membrane basale pour atteindre un volume final de 1 mL). Pour le composant collagène, ajoutez l’agent neutralisant qui l’accompagne (mélange 9:1 de collagène et d’agent neutralisant) et diluez le mélange avec 1x PBS pour obtenir un volume de 800 μL.
- Ajoutez 15 μL de suspension de collagène cellulaire dans chaque chambre musculaire du bioréacteur, en veillant à répartir la suspension sur les deux piliers à l’aide de la pointe de la pipette (Figure 2).
- Laissez le mélange cellule-gel polymériser à 37 °C pendant 30 min, puis remplissez bien chaque bioréacteur avec 450 μL de milieu de croissance myotonique.
- Après 3 jours (une fois que le gel s’est compacté), commencez la différenciation des myotubes.
5. Différenciation des myotubes (jours 0-14)
- Commencer la perfusion de myotubes en basculant les tissus à 450 μL de milieu induisant la fusion (FS, Tableau 1) pendant 7 jours, en changeant le milieu tous les deux jours.
note: Essayez de commencer la différenciation des myotubes le même jour que la différenciation des motoneurones à partir des hiPSC afin d'ensemencer les motoneurones à la fin des calendriers de différenciation des deux types de cellules.
- Au jour 7, changer le milieu à 450 μL de milieu de maturation Ia (MMIa, Tableau 1).
- Au jour 9, passer à 450 μL de milieu de maturation Ib (MMIb, tableau 1).
- Le 11e jour, remplacez le support par 450 μL de NbActiv4. Continuez à changer de support tous les 2 jours jusqu’à ce que les motoneurones soient ensemencés (étape 7).
6. Différenciation des motoneurones (jours 0-14)
- Le jour 0, transférer 4 x 10 6 cellules CHR2-hiPSC dans une boîte de Pétri à très faible fixation avec 15 mL de milieu de culture en suspension de motoneurones (MSCM, tableau 1). Complétez MSCM avec 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hydrate et 5 μM de dichlorhydrate d’Y-27632.
- Le jour 2, isolez les neurosphères (NS) à l’aide d’une passoire réversible de 37 μM et replaquez dans 15 mL de MSCM avec 3 μM de CHIR99021, 0,2 μM de LDN193189, 40 μM SB431542 hydrate et 0,1 μM d’acide rétinoïque. Après le jour 2, le NS devrait être visible dans la boîte de Pétri sans utiliser de microscope.
- Le jour 4, transférez les cellules et le milieu dans un tube de 50 ml et laissez les neurosphères se déposer au fond (5 min). Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 15 mL de MSCM complété par 0,5 μM SAG, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 et 0,1 μM d’acide rétinoïque.
- Le 7e jour, répétez l’étape 6.3, mais remettez les cellules en suspension dans 15 ml de MSCM complété par 0,5 μM SAG et 0,1 μM d’acide rétinoïque.
- Le jour 9, répéter l’étape 6.3, mais remettre les cellules en suspension dans 15 mL de MSCM complété par 10 μM de DAPT.
- Le 11e jour, répétez l’étape 6.3, mais remettez les cellules en suspension dans 15 ml de MSCM complété par 20 ng/mL de BDNF et 10 ng/mL de GDNF.
- Le jour 14, ensemencez les motoneurones dans la plate-forme.
7. Ensemencement des agrégats de motoneurones dans le bioréacteur (jour 14)
- Préparez un mélange de gel 4:1 de 2 mg/mL de collagène I et de Matrigel (800 μL de mélange de collagène + 200 μL de Matrigel pour atteindre un volume final de 1 mL). Pour le composant collagène, ajoutez l’agent neutralisant qui l’accompagne (mélange 9:1 de collagène à l’agent neutralisant) et diluez le mélange avec 1x PBS pour obtenir un volume final de 800 μL.
- Utilisez une passoire cellulaire de 400 nm pour sélectionner de grandes neurosphères et les remettre en suspension dans le mélange de gel.
- Aspirer le milieu du réservoir et soigneusement du puits de la neurosphère (Figure 2).
- Ajouter 15 μL de mélange de gel dans le canal de la neurosphère.
- Chargez une pipette de 10 μL avec 10 μL de gel, puis choisissez une neurosphère.
- Déposez le NS dans le canal de la neurosphère et assurez-vous que le NS est dans la chambre. Soulevez lentement la pipette tout en libérant le gel restant une fois le NS déposé. Si vous n’êtes pas certain que le NS a été correctement déposé, vérifiez son emplacement à l’aide d’un microscope.
- Laisser polymériser le gel pendant 30 min à 37 °C.
- Dans les réservoirs, ajoutez 450 μL de NbActiv4 complété par 20 ng/mL de BDNF et 10 ng/mL de GDNF.
- Changez de milieu tous les deux jours pour permettre la croissance axonale du NS au tissu musculaire.
8. Stimulation optique simultanée et enregistrement vidéo de la fonction NMJ (jour 24+)
- Pour l’imagerie, utilisez un microscope à fluorescence inversée avec une caméra scientifique à oxyde de métal, à semi-conducteur complémentaire (sCMOS).
- Réglez le binning logiciel de l’appareil photo sur 2x2, l’exposition sur 20 ms, l’obturateur roulant activé, le taux de lecture sur 540 MHz, la plage dynamique : 12 bits et gain 1, et le mode du capteur : chevauchement.
- Utilisez un objectif 2x sur le microscope pour imager les microtissus.
- Fixez une chambre de cellules vivantes (37 °C, 5 % de CO2) à la platine du microscope.
- Sélectionnez la région d’intérêt (ROI) qui contient les tissus squelettiques innervés afin de minimiser la taille du fichier et le temps de traitement.
- Placez un filtre d’émission passe-long de 594 nm entre l’échantillon et l’objectif d’imagerie pour filtrer les impulsions de lumière bleue de la caméra.
- Placez une plaque rectangulaire à 4 puits contenant 4 bioréacteurs (24 tissus) dans la chambre de la cellule vivante.
- Cliquez sur Live View. Centrez et concentrez l’image avec le retour sur investissement souhaité.
- Téléchargez le code de macro personnalisé à partir du dossier GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) pour contrôler la position de la scène, la carte Arduino et l’acquisition vidéo.
- Définissez la vidéo de sortie sur day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
- Exécutez le code macro avec les coordonnées X,Y souhaitées définies sur la scène et acquérez un time lapse rapide avec 1700 images à 50 images/s.
- Replacez le support après l’imagerie et remettez les échantillons dans l’incubateur. Prévoyez au moins 24 h entre les séances d’acquisition d’images pour éviter la fatigue des tissus.
