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1. Préparation de la lignée cellulaire
- Décongeler environ 1 000 000 de cellules de la moelle épinière du neuroblastome de souris (cellules NSC-34) qui étaient stockées dans un contenant d’azote liquide. Utilisez un incubateur d’eau à 37 °C jusqu’à ce que les cellules soient complètement décongelées.
- Ajoutez un milieu frais et chaud (milieu DMEM contenant 10 % de sérum de veau fœtal, 1 % de L-glutamine et 1 % d’antibiotiques à streptocoque).
- La centrifugeuse a décongelé les cellules (SL16R) à 500 x g pendant 5 min, formant une pastille de cellule. Jetez le milieu et ajoutez 1 mL de nouveau milieu pour la remise en suspension des cellules.
- Placez les cellules remises en suspension dans une fiole de 15 ml et ajoutez 5 ml de milieu supplémentaire. Incuber les cellules pendant la nuit dans un incubateur stérile avec 5 % de CO2 à 37 °C.
- En parallèle, placez 8 lamelles non enrobées (verre de protection : 12 mm, 0,13-0,17 mm d’épaisseur) dans une boîte de culture de 60 mm et stérilisez avec de l’éthanol à 70 % et exposez-les à 30 minutes de lumière UV jusqu’à ce qu’elles soient sèches. Ajoutez du milieu dans chaque plat et jetez-le pour éliminer l’éthanol résiduel.
- Ajoutez un tampon de trypsine (2,5 g de trypsine et 0,2 g d'EDTA dans 1 L de solution saline équilibrée de Hanks) aux cellules après qu'elles ont atteint environ 90 % de confluence (environ 6 millions de cellules par flacon) pour permettre aux cellules adhérentes de se dissocier.
REMARQUE : Les cellules NSC-34 sont sensibles et n’ont besoin que de 15 secondes d’incubation du tampon de trypsine et de 1 minute supplémentaire d’incubation sans trypsine avant la dissociation à l’aide du milieu.
- Déposer les cellules sur les boîtes de culture de 60 mm contenant déjà les lamelles avec 3 mL de milieu, soit environ 350 000 par boîte. Laissez-les dans l’incubateur pendant 24 h pour permettre la fixation des cellules sur les lamelles.
2. Validation de l’expression des protéines
- Placez sur de la glace des boîtes de culture de 60 mm contenant les cellules résiduelles (non utilisées dans l’expérience ci-dessus) de chaque groupe expérimental.
- Jetez le milieu et lavez les cellules deux fois avec du PBS pour diluer et laver le milieu restant.
- Traitez les cellules avec 200 à 400 μL de tampon de lyse contenant du PBS, 0,5 % de Triton et un comprimé cocktail d’inhibiteur de protéase (PI). Grattez à l’aide d’un grattoir à cellules.
- Recueillir les cellules dans un tampon de lyse dans un tube de microcentrifugation et homogénéiser avec un homogénéisateur à 4 000 tr/min pendant 1 min sous glace.
- Centrifuger les cellules homogénéisées à 2 500 x g pendant 10 min. Recueillir le surnageant, quantifier la concentration en protéines à l’aide d’un test de Bradford et le conserver à -20 °C jusqu’à l’utilisation.
- Prélever entre 30 et 70 μg de protéines totales (selon la protéine) et les charger dans un gel SDS-PAGE pour tester l’expression des protéines à l’aide d’un test immunoblot.