1. Détermination de l’expression relative des protéines de surface cellulaire dans les astrocytes par biotinylation
NOTE : Ici, nous illustrons l’application de cette technique de biotinylation à l’étude des effets de la laminine, une molécule de matrice extracellulaire, sur la localisation à la surface cellulaire du canal perméable à l’eau aquaporine-4 (AQP4). Les matériaux spécialisés requis pour cet essai comprennent le sulfo-NHS-LC-biotine (sulfosuccinimidyl 6-(biotinamido) hexanoate) et la résine de streptavidine-agarose (voir le tableau des matériaux).
- En utilisant cette méthode, préparez des cultures d’astrocytes corticaux environ 2 semaines avant le test et cultivez-les dans des flacons de culture ventilés de 75 cm. Lorsque les astrocytes sont confluents à 80 à 90 %, détachez-les de la surface de la culture à l’aide de 0,05 % de trypsine, puis faites-les passer 1:3.
- 48 heures avant le test, lorsque les cellules sont à nouveau confluentes à 80 ou 90 %, les astrocytes sont placés à 1:3 (en tenant compte du changement de format de culture) dans des boîtes de culture cellulaire de 60 mm de sorte qu’ils soient confluents à >70 % le jour où l’expérience doit avoir lieu. Assurez-vous que les cellules sont uniformément réparties entre les plats.
- 16 h avant le test, pipeter la laminine dans le milieu de culture jusqu’à une concentration finale de 24 nM et incuber à 37 °C.
- Immédiatement avant le dosage, préparez les éléments suivants, puis placez-les sur de la glace ou réfrigérez : CM-PBS (100 mg/L MgCl2∙6H2O et 100 mg/L CaCl2 dans une solution saline tamponnée au phosphate 1X [PBS], pH 7,4), tampon de biotine (0,5 mg/mL de sulfo-NHS-LC-biotine dans le CM-PBS), tampon d’extinction (50 mM NH4Cl dans le CM-PBS), tampon de lyse (25 mM Tris, pH 7,4, 25 mM de glycine, 150 mM de NaCl et 5 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique [EDTA], 1 % de triton X-100, 1X cocktail d’inhibiteur de protéase), 3X tampon de charge (150 mM de Tris, pH 6,8, 6 % de dodécylsulfate de sodium [SDS], 30 % de glycérol, 300 mM de dithiothréitol [DTT] et 0,01 % de bleu de bromophénol) et tampon de lavage (10 mM de Tris (pH 7,4), 1,5 mM d’EDTA, 150 mM de NaCl, 1 % de Triton X-100, 1X cocktail d’inhibiteurs de protéase).
- Retirez les plats contenant les cultures d’astrocytes de l’incubateur et jetez le milieu.
- Lavez les cellules trois fois avec 4 ml de CM-PBS réfrigéré et placez la vaisselle sur de la glace pilée.
- Pipetez 2 ml de tampon de biotine dans chaque puits et inclinez doucement les plats d’avant en arrière à quelques reprises pour assurer une couverture complète. Laisser sur la glace pendant 30 min.
- Retirez le tampon de biotine à l’aide d’un aspirateur et remplacez-le par un tampon de trempe de 4 ml. Laisser sur la glace pendant 10 min.
- Aspirez le tampon d’extinction et remplacez-le par un volume équivalent de celui-ci. Encore une fois, laissez sur la glace pendant 10 min.
- Jetez le tampon de trempe et lavez les cellules trois fois avec 4 ml de CM-PBS réfrigéré.
- Grattez les cellules dans 1 mL de CM-PBS réfrigéré à l’aide d’un élévateur de cellules et transférez la suspension dans un tube de microcentrifugation.
- Cellules en granulés par centrifugation à 100 x g pendant 3 min. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 500 μL de tampon de lyse.
- Laissez les échantillons sur de la glace pendant 30 min, en tourbillonnant toutes les 5 minutes, ou placez-les sur un rotateur bout à bout à 4 °C.
- Centrifugez le lysat à 14 000 x g pendant 10 min à 4 °C pour granuler toute matière insoluble dans un détergent. Transférez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation.
- Économisez 50 μL de ce lysat et ajoutez-y un tampon de chargement. Puis dénaturez-le en le chauffant à 95 °C dans un bain sec ; Il s’agit de la fraction « d’entrée », contenant à la fois des protéines biotinylées à la surface des cellules, ainsi que des protéines cytosoliques non biotinylées.
- Élargissez l’ouverture d’une pointe de pipette en coupant environ 0,5 cm de matériau à son extrémité à l’aide d’une paire de ciseaux tranchants. À l’aide de cette pointe de pipette, transférez 75 μL de billes de streptavidine-agarose (normalement stockées à 4 °C) dans le lysat, et incubez à 4 °C pendant 3 h sur agitateur/bascule.
- Comme la streptavidine-agarose est fréquemment vendue sous forme de suspension contenant 50 % de billes en volume, en suspension dans une solution antimicrobienne, triturez la suspension pour vous assurer que les billes sont uniformément suspendues, puis pipetez 150 μL de la suspension dans chaque échantillon.
- Billes de streptavidine-agarose par centrifugation à 1500 x g pendant 30 s à 4 °C.
- Économiser 50 μL du surnageant (ajouter un tampon de charge et le dénaturer à 95 °C dans un bain-marie ou un bloc chauffant) ; cela représente la fraction « intracellulaire » et est composée principalement de protéines cytosoliques non biotinylées.
- Remettez les billes en suspension dans un tampon de lavage de 1 mL et secouez-les pendant 3 min à 4 °C. Placez les billes (comme à l’étape 1.16) et jetez le surnageant. Répétez ce processus 4 fois pour minimiser la liaison non spécifique des protéines cytosoliques non biotinylées.
- Granulez les billes par centrifugation (1500 x g pendant 30 s à 4 °C) et jetez le tampon de lavage sus-jacent. Ajouter 50 μL de tampon de chargement 1X (dilué à l’aide d’un tampon de lyse). Libérer la biotine et la streptavidine des billes en les dénaturant à 95 °C ; Cette fraction ne doit contenir que des protéines biotinylées de surface cellulaire (fraction « surface cellulaire »).
- Séparez les fractions d’entrée, de surface cellulaire et intracellulaires par SDS-PAGE (électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide) et analysez-les par western blot.
note: Bien que nous ayons utilisé un gel à gradient préfabriqué de 4 à 20 % dans nos expériences, un gel de séparation de 12 à 14 % avec une couche d’empilement de 4 % (contenant chacune 0,1 % de SDS) devrait suffire pour les protéines d’intérêt dans cette étude. Un étalon de poids moléculaire de la gamme de taille appropriée doit également être utilisé. Notez qu’il peut parfois y avoir un changement observable dans les masses moléculaires apparentes des protéines biotinylées.