$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Détermination du taux d’internalisation des protéines de surface cellulaire dans les astrocytes par biotinylation
REMARQUE : Dans ce qui suit, nous décrivons une expérience typique de biotinylation par pulsation utilisée dans ce cas pour suivre l’endocytose d’AQP4 dans les astrocytes. Les matériaux spécialisés requis comprennent la biotine sulfo-NHS-SS, la résine de streptavidine-agarose, le glutathion réduit et l’iodoacétamide (voir le tableau des matériaux).
- Préparez des cultures d’astrocytes corticaux de souris dans des boîtes de 60 mm en utilisant les méthodes décrites dans la section précédente. Assurez-vous que les cellules sont confluentes à environ 70 % le jour du test et que chaque boîte contient un nombre équivalent de cellules.
- Immédiatement avant le dosage, préparez les éléments suivants et placez-les sur de la glace ou au réfrigérateur : CM-PBS ou solution saline tamponnée au phosphate (100 mg/L MgCl2∙6H2O et 100 mg/L CaCl2 dans 1X PBS, pH 7,4), tampon de biotine (0,5 mg/mL de sulfo-NHS-SS-biotine dans CM-PBS), tampon réducteur (50 mM de glutathion réduit, 75 mM de NaCl et 75 mM de NaOH), tampon de trempe (50 mM d’iodoacétamide, 1 % de BSA, dans CM-PBS), tampon de lyse (25 mM de Tris, pH 7,4, 25 mM de glycine, 150 mM de NaCl et 5 mM d’EDTA ou d’acide éthylènediaminetétraacétique, 1 % de triton X-100, 1X cocktail d’inhibiteur de protéase), tampon de charge 3X (150 mM de Tris, pH 6,8, 6 % de SDS ou de dodécylsulfate de sodium, 30 % de glycérol, 300 mM de DTT ou de dithiothréitol et 0,01 % de bleu de bromophénol), et tampon de lavage (10 mM Tris, pH 7,4, 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 % triton X-100, 1X cocktail d’inhibiteurs de protéase).
- Préparez un milieu de culture cellulaire frais (milieu Eagle modifié de Dulbecco, ou DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 1 % de pénicilline/streptomycine et 1 % de L-glutamine), et placez-le dans un bain-marie à 37 °C.
- Retirez les cultures d’astrocytes de l’incubateur et aspirez le milieu à l’aide d’un aspirateur.
- Lavez les cellules trois fois avec 4 mL de CM-PBS réfrigéré et placez la vaisselle sur de la glace pilée.
- Pipetez 3 ml de tampon de biotine dans chaque plat, inclinez les plats d’avant en arrière à quelques reprises pour vous assurer que le tampon est bien réparti et laissez sur la glace pendant 30 minutes.
- Aspirez le tampon de biotine et remplacez-le par un produit chaud de 5 ml. Incuber une boîte de culture à 37 °C pendant 15 min, et une deuxième boîte à la même température pendant 30 min. Laisser un autre plat à 4 °C comme échantillon de 0 min.
- À la fin de la période d’incubation, jeter le milieu et laver les cellules trois fois avec 4 mL de CM-PBS réfrigéré. Pipeter un tampon réducteur de 6 mL sur les cellules et les laisser sur de la glace pendant 15 min.
- Retirez le tampon réducteur et remplacez-le par 6 ml de tampon réducteur frais. Placez le mélange sur de la glace pendant 15 minutes supplémentaires.
- Retirer la solution réductrice et la remplacer par un tampon de trempe de 6 ml. Laisser sur la glace pendant 15 min.
- Répétez l’étape de trempe une fois de plus.
- Jetez le tampon d’extinction et lavez les cellules trois fois avec 4 ml de PBS réfrigéré.
- À l’aide d’un élévateur de cellules, grattez les cellules dans 1 mL de PBS réfrigéré et transférez la suspension dans un tube de microcentrifugation.
- Cellules en granulés par centrifugation à 100 x g pendant 3 min. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans un tampon de lyse de 500 μL.
- Laissez-le sur la glace pendant 30 min et agitez au tourbillon toutes les 5 min. Vous pouvez également placer les échantillons sur un rotateur bout à bout à 4 °C pendant cette durée.
- Centrifugez le lysat à 14 000 x g pendant 10 min à 4 °C pour granuler les matériaux insolubles au détergent, puis transférez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation. Conserver 50 μL de ce lysat, y ajouter un tampon de charge et le dénaturer à 95 °C dans un bain sec ; Il s’agit de la fraction « d’entrée », contenant à la fois des protéines endocytosées biotinylées et des protéines non biotinylées.
- À l’aide d’une pointe de pipette coupée, ajouter 150 μL de suspension de streptavidine-agarose au lysat et incuber à 4 °C pendant 3 h sur un agitateur/bascule.
- Billes de streptavide-agarose par centrifugation à 1 500 x g pendant 30 s à 4 °C.
- Remettre les billes en suspension dans 1 mL de tampon de lavage et les faire basculer pendant 3 minutes à 4 °C. Déposer les billes (selon l’étape 1.18) et jeter le surnageant. Répétez ce processus 4 fois pour minimiser la liaison non spécifique des protéines cytosoliques non biotinylées.
- Granulés par centrifugation à 1 500 x g pendant 30 s à 4 °C et jeter le tampon de lavage sus-jacent. Ajouter 50 μL de tampon de charge 1X (dilué à l’aide d’un tampon de lyse). Libérer la biotine et la streptavidine des billes par dénaturation à 95 °C ; Cette fraction ne doit contenir que des protéines internalisées à la surface des cellules (fraction « endocytosée »).
- Séparation des fractions d’entrée, de surface cellulaire et non liées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE), et analysées par western blot.
note: Bien que nous ayons utilisé un gel à gradient préfabriqué de 4 à 20 % dans nos expériences, un gel de séparation de 12 à 14 % avec une couche d’empilement de 4 % (contenant chacune 0,1 % de SDS) devrait suffire pour les protéines d’intérêt dans cette étude. Un étalon de poids moléculaire de la gamme de taille appropriée doit également être utilisé. Notez qu’il peut parfois y avoir un changement observable dans les masses moléculaires apparentes des protéines biotinylées.