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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des matrices
- Faites bouillir 4 à 8 matrices de silicone au micro-ondes ou sur une plaque chauffante pendant 5 min et laissez-les sécher complètement pendant 1 h sous flux laminaire (côté rayé vers le haut).
note: Les procédures suivantes doivent être effectuées sous flux laminaire.
- Soufflez de l’air comprimé ou utilisez du ruban adhésif transparent pour enlever la poussière du côté rayé des matrices. Gardez le côté rayé propre afin qu’il puisse adhérer fermement à la surface de la plaque.
- Placez délicatement les matrices sur des plats en plastique de 6 cm en appuyant avec un doigt (une matrice par plat ; côté rayé vers le bas). Évitez de faire des bulles d’air entre la matrice et le plat. Marquez l’emplacement des rayures sur la face inférieure de la boîte de culture.
- Si la matrice ne parvient pas à se fixer, répétez l’opération à partir de l’étape 1.2.
2. Génération de bandes et revêtement de laminine pour la culture de neurones
- Préparez une protéine recombinante marquée par fluorescence (25 μl chacun pour l’injection [étape 2.2] ou 100 μl chacun pour la méthode de placement [étape 2.2.1]) en mélangeant la protéine marquée Fc (10-50 μg/ml) et un anticorps anti-Fc humain conjugué à un colorant fluorescent (rapport 1 à 3 : 30-150 μg/ml) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Ensuite, incubez le mélange pendant 30 min à RT.
- À l’aide d’une seringue de 22 G, injecter 25 μl de la protéine recombinante préparée à l’étape précédente (2.1) à travers le petit trou situé sur le côté de la matrice (flèches sur les figures 1A, 1C et 1E).
- Alternativement, placez 100 μl de la protéine recombinante dans la fente supérieure de la matrice et aspirez environ la moitié de la solution du petit trou (flèches sur les figures 1A, 1C et 1E), de sorte que la protéine recombinante reste dans les régions rayées.
- Incuber la boîte pendant 30 min à 37 °C dans un incubateur de culture cellulaire.
- Placez 300 μl de PBS dans la fente supérieure (figure 1B) et aspirez par le petit trou situé sur le côté de la matrice (flèches sur les figures 1A, C et E) pour éliminer les protéines recombinantes non attachées. N’aspirez pas complètement le PBS, car les protéines vont sécher. Répétez cette étape deux fois. (3 fois au total)
- Retirez délicatement la matrice et placez immédiatement ~100 μl de protéine de contrôle (10-50 μg/ml ; Fc) pour couvrir toute la zone rayée, en créant un revêtement alternatif. Ensuite, incubez la boîte pendant 30 min à 37 °C dans l’incubateur de culture cellulaire.
- Après avoir lavé la surface du plat trois fois avec du PBS, enduisez-la de ~100 μl de laminine de 20 μg/ml de PBS.
note: La laminine doit être décongelée sur de la glace pour éviter la solidification.
- Incuber la boîte pendant 1 h à 37 °C dans l’incubateur de culture cellulaire.
- Lavez la surface du plat trois fois avec du PBS et ajoutez du milieu de culture. Placez le plat enduit de milieu de culture dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C jusqu’à utilisation.
3. Culture de neurones hippocampiques à partir d’embryons de souris E15.5
- Euthanasier la mère par luxation cervicale et isoler trois embryons E15.5.
- Coupez la peau et le crâne sagittairement à la ligne médiane de la tête avec des ciseaux et retirez le cerveau à l’aide d’une petite cuillère. Transférez soigneusement le cerveau dans une boîte de Pétri de 60 mm contenant 3 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS).
- À l’aide d’un scalpel, découpez les hémisphères, y compris le cortex, l’hippocampe et le striatum (Figure 2A). Ensuite, disséquez la région de l’hippocampe en retirant soigneusement les méninges, et transférez les tissus de l’hippocampe disséqués dans un tube à centrifuger de 15 ml contenant 2 ml de solution HBSS, sur de la glace (Figure 2B-C). Prélevez 6 hippocampes de 3 embryons dans le tube, ce qui est suffisant pour cultiver des neurones dans 8 boîtes.
- Remplacer la solution HBSS par une solution de trypsine/acide éthylènediamine tétraacétique (trypsine/EDTA) (2 ml) et incuber le tube à 37 °C pendant 15 min dans un bain-marie.
note: Aspirez le HBSS sans centrifugation et ne décantez pas la solution HBSS en inclinant le tube.
- Neutraliser l’activité de la trypsine en ajoutant 500 μl de sérum fœtal bovin (FBS).
- Centrifuger le mélange à 100 x g pendant 5 min. Retirer le surnageant et laver la pastille avec 2 ml de milieu de culture. Répétez cette étape une fois de plus.
- Pipetez l’hippocampe de haut en bas 10 fois dans un milieu de culture à l’aide d’une pointe de 1 000 μl avec un grand trou (pointe coupée) pour dissocier le tissu.
- Passez à une pointe régulière (non coupée) de 1 000 μl et pipetez le tissu dissocié de haut en bas pour obtenir une suspension unicellulaire.
- Séparez les cellules individuelles en les faisant passer dans une crépine à mailles de 80 à 100 μm.
- Centrifuger la suspension monocellulaire filtrée à 150 x g pendant 5 min.
- Retirer le surnageant par aspiration et remettre en suspension la pastille (neurones) dans 2 ml de milieu de culture.
- Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre avec coloration au bleu de trypan pour déterminer la densité et la viabilité. Ensuite, disposez 10 000 neurones dans 150 μl de milieu de culture pour chaque ensemble de bandes. La suspension doit être soigneusement placée pour couvrir toute la région de la bande.
