Accouchement d’un traumatisme crânien dans le cerveau d’une souris

Résumé

Source : Zhong, J., et al. Imagerie intravitale de l’expression des protéines fluorescentes chez des souris atteintes d’une lésion cérébrale traumatique à crâne fermé et d’une fenêtre crânienne à l’aide d’un microscope à deux photons. J. Vis. Exp. (2023)

Cette vidéo démontre l’administration de lésions cérébrales traumatiques (TCC) chez la souris. Après avoir exposé le crâne, le site du TCC est marqué. La souris est ensuite positionnée sous le dispositif TBI. L’impact est délivré en soulevant la tige métallique et en la laissant tomber librement sur l’impacteur, qui est en contact avec le crâne.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Administration d’une induction de traumatisme craniocérébral répétitif (TCC)

REMARQUE : Les paramètres du TBI sont ajustés à partir des rapports précédents, dans lesquels l’impact du TBI a été produit une fois. Le protocole applique ici le même paramètre, sauf l’augmentation du nombre total d’impact à 10.

1. Équipement TBI
   1. Utilisez un appareil portable conçu sur mesure pour administrer un traumatisme crânien fermé (figure 1A) à la tête de la souris du côté droit, comme indiqué à la figure 1B.
2. Préparation avant l’intervention chirurgicale
   1. Équipement chirurgical en autoclave, y compris des ciseaux ordinaires, un pied à coulisse chirurgical, des ciseaux chirurgicaux à ressort, des pinces chirurgicales, des pinces à moustiques, des pièces de poteau de tête, de la gaze et des applicateurs à embout de coton.
   2. Pesez et notez le poids corporel de la souris 2 h avant la chirurgie. Pour minimiser l’œdème cérébral lors de l’implantation de la fenêtre crânienne, injectez du phosphate sodique de dexaméthasone à une dose de 4,8 mg/kg [2 mg/mL, généralement ~70 μl (nécessité d’injecter à deux sites)] dans le muscle quadriceps à l’aide d’une seringue à insuline. Après l’injection de dexaméthasone, mais avant de commencer la chirurgie TCC, préparez les fenêtres en verre comme indiqué à l’étape 2.1 pour une utilisation ultérieure.
   3. Désinfectez le stade chirurgical et le matériel TCC avec de l’éthanol à 75 %. Élargissez le champ chirurgical stérile jetable pour couvrir l’étape de l’opération sur la plate-forme stéréotaxique. Allumez l’appareil de chauffage et le moniteur de température en réglant la température cible sur 37 °C.
   4. Ouvrez la vanne de la bouteille d’oxygène et réglez le débit d’oxygène à 1,5 L/min. Ouvrez l’appareil d’anesthésie et réglez la valeur du niveau d’isoflurane sur 3.
      REMARQUE : L’oxygène 100 % pur peut aider l’animal à survivre aux impacts TCC.
   5. Placez la souris dans la chambre d’induction et laissez-la reposer pendant 5 minutes pour obtenir une anesthésie complète.
   6. Une fois que la souris est complètement anesthésiée (c’est-à-dire une respiration lente mais régulière d’environ un cycle toutes les 2 s, associée à l’absence de réflexe de pincement de la queue), retirez la souris de la chambre d’induction et placez la tête de la souris dans le cadre stéréotaxique.
   7. Placez le cône nasal du tube d'anesthésie sur le museau de la souris.
   8. Maintenez l’anesthésie à l’aide d’isoflurane à 1,5 % mélangé à de l’oxygène pur à 100 % à un débit de 1 L/min jusqu’à la fin de la chirurgie. Vérifiez périodiquement la fréquence de la respiration et effectuez un pincement de la queue ou des orteils au moins toutes les 15 minutes tout au long de la chirurgie pour évaluer l’anesthésie appropriée. Ajustez la concentration d’isoflurane au besoin pour maintenir la profondeur souhaitée de l’anesthésie.
3. Chirurgie TCC
   1. Administrer de la buprénorphine (1 mg/kg, par voie sous-cutanée) à l'aide de seringues à insuline jetables et appliquer une pommade ophtalmique sur les yeux de la souris.
   2. Retirez les cheveux du haut de la tête en les taillant avec des ciseaux 1 puis en appliquant un agent dépilatoire pendant 1 min.
      ATTENTION : N’appliquez pas le produit dépilatoire pendant plus de 3 minutes sur le cuir chevelu, car il s’agit d’un irritant cutané. Évitez également de mettre un agent dépilatoire dans les yeux de la souris.
   3. Nettoyez la peau du cuir chevelu en appliquant de la gaze et des applicateurs à coton. Ensuite, désinfectez la peau, en utilisant d’abord de l’éthanol à 75 %, puis de la bétadine. Répétez cette opération trois fois (c’est-à-dire l’éthanol suivi de la bétadine), en laissant l’application finale de la bétadine sur la peau.
   4. Vérifiez à nouveau la profondeur de l’anesthésie pour vous assurer que la souris est complètement anesthésiée (c.-à-d. une respiration lente mais régulière à environ un cycle toutes les 2 s, associée à l’absence de réflexe de pincement de la queue). Tentez la peau à l’aide d’une pince chirurgicale 3 et faites une incision médiane de 12 à 15 mm de long, en commençant à environ 3 mm en arrière des yeux.
   5. Exciser la peau sur les hémisphères gauche et droit du crâne à l’aide de ciseaux à ressort 2.
   6. Une fois le crâne exposé, retirez le périoste en le frottant doucement avec un applicateur stérile à bout de coton et en le rinçant avec une solution saline stérile.
   7. Inspectez visuellement l’état du crâne pour vous assurer qu’il est intact, à l’exception des deux petits trous qui ont été faits pour la chirurgie d’injection de virus précédente.
   8. Séchez la région du crâne et marquez le site d’impact du traumatisme crânien aux coordonnées suivantes : 2,5 mm en arrière du Bregma et 2 mm latéralement à partir de la suture sagittale vers la droite (figure 1B).
   9. Retirez rapidement la souris du cadre stéréotaxique et placez la tête sur le coussin tampon sous le dispositif TBI.
   10. Alignez l’extrémité de l’impacteur avec le site d’impact marqué.
   11. Soulevez la colonne métallique en tirant sur la corde de nylon attachée à 15 cm au-dessus de la tête de la souris, puis relâchez-la, en laissant le poids tomber librement sur la tige du transducteur, qui est en contact avec le sommet du crâne sur le site du traumatisme crânien. Ne touchez pas la tête de la souris lors de l’impact TBI.
   12. Déplacez la souris sur la couverture chauffante et placez-la sur son dos tout en surveillant l’état de la respiration.
   13. Une fois que la souris passe d’une position couchée à une position couchée, placez-la dans la chambre d’induction de l’isoflurane pendant ~5 min avec 3 % d’isoflurane mélangé à de l’oxygène pur à 100 % à un débit de 1,5 L / min.
   14. Une fois que la souris est complètement sous sédation (c.-à-d. une respiration lente mais régulière d’environ un cycle toutes les 2 s, associée à l’absence de réflexe de pincement de la queue), répétez les étapes 1.3.9 à 1.3.14 pour obtenir un total de 10 impacts.
       REMARQUE : Dix impacts de TCC ont été trouvés pour induire un phénotype robuste avec une faible mortalité chez la souris dans notre étude (données non encore publiées). Les paramètres peuvent être ajustés pour obtenir une gravité différente de lésion cérébrale en augmentant ou en diminuant le nombre d’impacts et/ou la hauteur à partir de laquelle le poids est relâché. Tous les paramètres sont soumis à l’approbation de l’IACUC local.
   15. Vérifiez le crâne à l’aide d’un microscope chirurgical et retirez la souris de l’étude si une fracture du crâne s’est produite.
   16. Pour les chirurgies simulées, suivez les mêmes procédures que celles décrites ci-dessus, y compris placer l’animal sous l’impacteur, mais sans administrer les impacts TCC.
   17. Une fois que la souris est passée d’une position couchée à une position couchée à la suite du 10e impact TBI, placez-la dans la chambre d’induction de l’isoflurane pendant ~5 min. Ensuite, suivez les étapes 1.2.6-1.2.8 pour placer la tête de la souris sur le cadre stéréotaxique pour la chirurgie d’implantation de fenêtre crânienne décrite ci-dessous.

Résultats

Figure 1 : Diagrammes de l’appareil TBI, du site d’impact TBI et de la préparation de la fenêtre. (A) Équipement pour le dispositif de chute de poids. 1 : piédestal, 2 : support, 3 : pince réglable, 4 : corde en nylon, 5 : tunnel de chute de poids, 6 : colonne de poids en métal (50 g), 7 : impacteur, 8 : coussin tampon. (B) Un schéma du site d’injection du virus et d’impact du TCC, avec les co...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pinceaux applicateurs de précision réglables	Parkell	S379
Seringue à insuline BD	Bd	NDC/HRI#08290-3284-38	5/16 po x 31 g
Bétadine	Purdue	NDC67618-151-17	Dont 7,5 % de povidone iodée
Buprénorphine	PAR Pharmaceutique	NDC 42023-179-05
Ethonal	Fisher Scientific	Référence 04355223EA	75 %
Appareils de chauffage	CWE	Souris TC-1000	Equipé de l’instrument stéréotaxique et être utilisé lors de l’opération chirurgicale
Couverture chauffante	Pharmacie CVS	E12107	Appareil de chauffage d’appoint et être utilisé après la chirurgie
Pommade ophtalmique lubrifiante	Picétal	NDC 46066-753-55
marqueur	Delasco	SMP-BK
Pinces anti-moustiques	Caroline	Article # :625314	Acier inoxydable, incurvé, 5 po
Agent dépilatoire	Société McKesson	n/a	Nair Hair Lotion dépilatoire à l’aloès et à la lanoline
Ciseaux réguliers 1	Eurostat	Eurostat ES5-300
Ciseaux réguliers 2	Instruments de précision mondiaux	Réf. 501759-G
salin	Le monde biologique	L19102411PR
Ciseaux à ressort 1	Instruments de précision mondiaux	Réf. 91500-09	Pointe droite
Ciseaux à ressort 2	Instruments de précision mondiaux	N° d’article 91501-09	Pointe droite
Plateforme stéréotaxique	KOPF	Modèle 900LS
Pince chirurgicale 1	SCIENCES DE LA MICROSCOPIE ÉLECTRONIQUE	N° de catalogue # 0508-5/45-PO	Style 5/45, incurvé
Pince chirurgicale 2	SCIENCES DE LA MICROSCOPIE ÉLECTRONIQUE	catlog# 0103-5-PO	Style 5, droit
Pince chirurgicale 3	SCIENCES DE LA MICROSCOPIE ÉLECTRONIQUE	N° de téléphone# 72912
Pince chirurgicale 4	SCIENCES DE LA MICROSCOPIE ÉLECTRONIQUE	N° de catalogue # 0508-5/45-PO	Style 5/45, incurvé
Lampe chirurgicale	Leica	Leica KL300 à LED
Adhésif tissulaire Vetbond	Soins aux animaux 3M	Numéro de pièce :014006