Immunomarquage par fluorescence de neurones de l’hippocampe du rat au sein d’une puce microfluidique

Résumé

Source : Nagendran, T., et al., Utilisation de puces microfluidiques en plastique pré-assemblées pour compartimenter les neurones murins primaires. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo démontre la coloration par immunofluorescence de neurones de l’hippocampe de rat cultivés dans une puce microfluidique pour analyser la maturation et la connectivité neuronales.

Protocole

1. Immunomarquage par fluorescence au sein de la puce

1. Préparer une solution de fixation de formaldéhyde à 4 % dans du PBS (formaldéhyde à 4 %, 1 μM MgCl₂, 0,1 μm CaCl₂, 120 mM de saccharose)
2. Retirez la plupart des supports dans les puits de la puce (ne pas sécher les compartiments intérieurs).
3. Ajouter immédiatement 100 μL de solution de fixation dans les puits supérieurs des compartiments axonaux et somatiques.
4. Après 1 min, ajoutez 100 μL de solution de fixation dans les puits de fond. Laisser reposer 30 min à température ambiante.
5. Retirez la majeure partie de la solution des puits de la puce (ne pas sécher les compartiments intérieurs). Ajouter immédiatement 150 μL de PBS dans chacun des puits supérieurs des compartiments axonaux et somatiques. Attendez 2 min que le PBS s’écoule dans les puits de fond.
6. Répétez l’étape 1.5 deux fois.
7. Retirez la majeure partie du PBS des puits de la puce. Ajouter immédiatement 150 μL de PBS avec 0,25 % de TritonX-100 dans chacun des puits supérieurs des compartiments axonal et somatique. Attendez 15 min.
8. Retirez la majeure partie du liquide des puits de la puce et ajoutez immédiatement 150 μL de solution bloquante (10 % de sérum de chèvre normal dans du PBS) dans chacun des puits supérieurs des compartiments axonaux et somatiques. Attendre 15 min.
   note: Les solutions de blocage efficaces doivent être spécifiques à l’anticorps secondaire, par exemple, pour un anticorps secondaire anti-mouton d’âne, utilisez du sérum d’âne dans la solution de blocage.
9. Retirez la majeure partie du liquide des puits de la puce et ajoutez immédiatement 100 μL d’anticorps primaires (ou d’anticorps) dans du sérum de chèvre normal à 1 % dans du PBS à chacun des puits supérieurs des compartiments axonaux et somatiques. Couvrir pour minimiser l’évaporation et attendre 1 h à température ambiante ou 4 °C toute la nuit.
10. Retirez la majeure partie de la solution des puits de la puce (ne pas sécher les compartiments intérieurs). Ajouter immédiatement 150 μL de PBS dans chacun des puits supérieurs des compartiments axonaux et somatiques. Attendez 5 min que le PBS s’écoule dans les puits de fond.
11. Répétez l’étape 1.10 deux fois.
12. Retirez la majeure partie du liquide des puits de la puce et ajoutez immédiatement 100 μL d'anticorps secondaires (ou d'anticorps) dans le PBS à chacun des puits supérieurs des compartiments axonaux et somatiques. Couvrir pour minimiser l’évaporation et attendre 1 h à température ambiante.
    note: Reportez-vous aux instructions du fabricant pour la dilution recommandée des anticorps secondaires.
13. Répétez les étapes 1.10-1.11.
14. Si l’imagerie est dans la journée suivant l’immunomarquage, gardez la puce remplie de PBS. Si la puce doit être conservée plus d’un jour avant l’imagerie, enveloppez la boîte contenant la puce dans un film de paraffine pour éviter l’évaporation et conservez-la à 4 °C jusqu’au moment de l’image.
15. Pour le stockage à long terme des échantillons, des supports de montage (par exemple, Fluoromount-G) peuvent être utilisés.
    1. Retirez la majeure partie du liquide des puits de la puce. À l’aide d’une pipette en plastique jetable de 1 ml, ajoutez 2 gouttes de milieu de montage dans chacun des puits supérieurs des compartiments axonaux et somatiques.
    2. Inclinez la puce pour favoriser l’écoulement du support de montage à travers les canaux. Après 5 min, ajoutez 2 gouttes dans les puits du fond. Attendre 1 h avant de cardier.
       note: Après avoir utilisé un support de montage, il ne sera pas possible de sonder à nouveau pour d’autres cibles.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
XonaChip	Xona Microfluidics, LLC	XC150	Barrière à microrainures de 150 μm de longueur
XonaChip	Xona Microfluidics, LLC	XC450	Barrière à microrainures de 450 μm de long
XonaChip	Xona Microfluidics, LLC	XC900	Barrière à microrainures de 900 μm de long
Pré-couche XC	Xona Microfluidics, LLC	Pré-couche XC	inclus avec XonaChips
XonaPDL	Xona Microfluidics, LLC	XonaPDL
Milieu neurobasal	ThermoFisher Scientific	21103049
Pipettes Pasteur en verre	Sigma-Aldrich	CLS7095D5X SIGMA
Percer 16 % formaldéhyde	ThermoFisher Scientific	Référence 28906
PBS (10x)	ThermoFisher Scientific	QVC0508
Sérum de chèvre normal	ThermoFisher Scientific	16210064
Triton X-100	ThermoFisher Scientific	Référence 28314
Anticorps anti-vGlut1	NeuroMab	Référence 75-066	clone N28/9, 1:100
Anticorps secondaires Alexa Fluor	ThermoFisher Scientific		17 h 40
Système d’imagerie confocale à disque rotatif	Technologie Andor	CSU-X1, iXon X3 EMCCD	60x huile silicone et 20x objectifs