1. Marquage fluorescent et immunocytochimie
Remarque : Le marquage immunofluorescent des cultures de cellules corticales primaires a été effectué dans des boîtes de culture cellulaire à fond de verre de 35 mm d’un volume de travail de 1 ml.
- Lavez deux fois le plat à fond de verre avec une solution saline tamponnée au phosphate pH 7,4 (PBS).
- Fixez les cellules avec 4 % de paraformaldéhyde pendant 15 min à température ambiante (RT).
- Laver les cellules deux fois avec du PBS et perméabiliser avec 0,1 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 5 min.
- Traitez les cellules pendant 20 min à la RT avec un colorant spécifique de la F(filamenteuse)-actine, AlexaFluor 488 Phalloidin (1:40, 25 μl de Phalloïdine dans 1 ml de PBS).
- Rincer les cellules deux fois avec du PBS et bloquer avec 10 % de sérum de chèvre normal à RT pendant 1 à 2 heures.
- Diluer l’anticorps polyclonal anti-MAP2 (protéine 2 associée aux microtubules) de poulet (1:2 500) dans du PBS avec 2 % de sérum de chèvre normal et incuber O/N (toute la nuit) à 4 0°C.
- Après l’incubation, rincer deux fois au PBS.
- Diluer l’anticorps secondaire (IgG de chèvre conjugués Alexa Red 594 anti-poulet (1:500)) avec 2 % de sérum de chèvre normal et incuber pendant 2 heures à RT.
- Rincer au PBS et ajouter 10 μl/plat de colorant Hoescht.
- Incuber pendant 3 min à RT et laver deux fois avec PBS.
note: Les cellules marquées sont maintenant prêtes pour l’étape 2 (comptage de l’actine F).
- Conservez l’échantillon cellulaire avec 100 μl de réactif anti-décoloration comme agent de lamelle et maintenez-le à 4 0°C dans l’obscurité pour un stockage à long terme.
note: La phalloïdine est relativement stable dans le PBS à +4 °C dans l’obscurité jusqu’à 1 semaine, et la fluorescence peut être préservée avec des réactifs anti-décoloration de lamelle. Cependant, des images optimales sont obtenues de 1 à 3 jours après la coloration, car la phalloïdine peut commencer à se diffuser avec un stockage prolongé.
2. Comptage ponctué d’actine F
- Allumez le microscope fluorescent et passez à l’objectif 20×. Ouvrez le logiciel de microscope et configurez le programme à une taille d’image de 1280×960 pixels et une résolution d’image de 0,17 μm/pixel avec un zoom de 1×.
- Acquérir des images de neurones F-actine/MAP2 co-marqués sous des canaux fluorescents verts (495 nm) ou rouges (613 nm).
- Choisissez 5 images fluorescentes vertes (F-actine)/rouges (MAP2) immunomarquées/bleues (Hoescht) de neurones individuels avec des arborescences dendritiques clairement définies.
- Identifier les structures riches en F-actine dans le segment dendritique de deuxième ordre (plage de longueur 25-75 μm) avec immunofluorescence MAP2 continue.
- Faites pivoter la zone sélectionnée des images à un niveau horizontal. Copiez et collez en tant que nouvelle image.
- Soustrayez l’arrière-plan des images, en utilisant un ajustement cohérent pour chaque plat.
- Comptez le point d’actine F vert vif et tracez la longueur du segment dendritique sélectionné manuellement par des observateurs indépendants formés. Exportez les données dans un fichier tableur.
- Calculez la masse volumique en divisant le total des points marqués à l’actine F (N) par la longueur (L) des dendrites marquées à MAP2. Exprimer les données en nombre de points d’actine F par 10 μm de dendrite
note: Des points (taille ≤1,5 μm) de fluorescence de l’actine F avec une intensité maximale d’au moins 50 % supérieure à l’intensité moyenne de coloration dans la tige dendritique ont été inclus dans chaque segment dendritique sélectionné.
