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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Animaux
- Utilisez des rats mâles et femelles âgés de 3 mois dans cette étude.
- Gardez les animaux dans un cycle lumière/obscurité de 12 heures avec un accès libre à la nourriture et à l’eau.
2. Préparation du cocktail KAX (kétamine + xylazine + acépromazine) pour l’anesthésie animale
- Dissoudre 50 mg de xylazine (20 mg/ml) dans 5 ml de kétamine (100 mg/ml) avec 1 ml d’acépromazine (10 mg/ml) et 3 ml d’eau distillée. Mélanger.
- Stérilisez à l’aide d’un filtre à seringue et conservez cette solution dans un flacon de sérum de 10 ml.
3. Injection KAX
- Peser l’animal (g) et le remettre dans la cage jusqu’à ce qu’il soit prêt à être injecté.
- Injecter 0,1 ml de KAX/100 g de poids corporel d’animal par voie intrapéritonéale, à l’aide d’une seringue à insuline de 1 ml avec une aiguille de 28 g.
- Permettez à l’animal de devenir inconscient. Vérifiez les réflexes en pinçant les pieds et la queue.
- Gardez tous les animaux en sécurité dans le laboratoire pendant toute la durée de l’opération.
- Après l’opération, replacez les animaux dans leurs cages et restez à l’aise à température ambiante (RT) jusqu’à ce que la conscience soit retrouvée. Ne renvoyez les animaux à l’animalerie que lorsque les animaux se réveillent et reprennent un comportement normal.
4. Préparation à la chirurgie et assemblage des micro-aiguilles
- Préparez une solution stérile de 2 M de NaCl.
- À l’aide d’un extracteur de microélectrodes (figure 1C), tirer un tube en borosilicate épais poli et à paroi mince de 0,86 mm de diamètre intérieur en deux micro-aiguilles de verre finement effilées (figure 1D, figure 1E).
- Remplissez une micro-aiguille de l’étape précédente avec une solution saline de 2 M à l’aide d’une aiguille de seringue de remplissage et d’une seringue de 1 ml (figure 1B). Tapotez les bulles d’air de la pointe de l’électrode.
- Remplissez une deuxième seringue de 1 ml avec du NaCl 2 M. Connectez une aiguille de 18 G, puis fixez une longueur (environ 10 pouces) de tube en polyéthylène (Figure 1A). À l’aide du piston de la seringue, le tube en polyéthylène est rempli de solution saline à travers l’aiguille.
- Lorsque la micro-aiguille et le tube sont remplis de solution saline, connectez soigneusement les deux. Éliminez tout air dans la connexion entre eux (Figure 2).
- Biseautez finement la pointe de la micro-aiguille en la grattant très légèrement dans le sens contraire du grain d’un essuie-tout.
- Vérifiez la résistance de la micro-aiguille en poussant doucement le piston sur la seringue jusqu’à ce qu’un fin filet de liquide soit visible sur l’essuie-tout. Le jet de liquide ne doit pas dépasser 0,5 mm.
5. Préparation de l’animal
- Appliquez 1 à 2 gouttes d’anesthésique topique sur la cornée (solution ophtalmique de chlorhydrate de proparacaïne, USP, 0,5 %). Attendez qu’aucun réflexe oculaire ne se produise.
- Coupez les moustaches avec des ciseaux.
- Imbibez un applicateur à embout de coton avec une solution de bétadine et tamponnez la zone autour de l’œil expérimental.
- À l’aide d’un microscope, fixez un hémostat pour clamper la paupière inférieure afin de gonfler l’œil, d’exposer la veine épisclérale et de restreindre les mouvements oculaires. (Figure 3, pointe de flèche)
6. Injection saline induisant le glaucome
- Lorsque l’assemblage de la micro-aiguille et l’animal sont prêts, commencez les injections.
- Lorsqu’il est confirmé que l’animal ne répond pas au pincement des pattes ou de la queue, percez soigneusement la veine épisclérale avec la micro-aiguille en arrivant à un faible angle entre 10 et 20 degrés par rapport à la veine (figure 3, flèche blanche). Une ponction réussie dans la veine est apparente lorsque le sang pénètre dans l’extrémité de la micro-aiguille (Figure 3, flèche noire).
- Injectez lentement et manuellement environ 50 μl de solution saline dans la veine. Cela devrait prendre environ 10 secondes. Les veines blanchissent au fur et à mesure que le sel circule dans le système vasculaire (figure 4, pointe de flèche). Certaines régions peuvent conserver une apparence rouge sang (Figure 4, flèche).
- Effectuez une deuxième injection dans la veine, à l’opposé du site de la première, pour assurer des lésions rétiniennes complètes de la couche de cellules ganglionnaires rétiniennes.
Remarque : En quelques minutes, on devrait voir une apparence trouble distincte à travers l’iris de l’œil lorsque le sel circule dans le système vasculaire.
- Laissez l’œil opposé non traité pour l’utiliser comme contrôle interne.
