Isolement des fibrilles amyloïdes à partir d’un extrait de tissu cérébral

Résumé

Source : Upadhyay, A. et al., Purification biochimique et caractérisation protéomique des noyaux de fibrille amyloïde du cerveau. J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo démontre le protocole d’isolement des fibrilles amyloïdes à partir d’extraits de tissu cérébral de souris en utilisant la centrifugation à gradient de densité et la digestion de protéines non amyloïdes.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Prélèvement de tissus et purification de l’amyloïde

REMARQUE : Idéalement, les fibrilles amyloïdes devraient être isolées à partir de régions cérébrales fraîchement disséquées. Cependant, cette méthode fonctionne également bien avec les tissus cérébraux congelés ou instantanés. Vous trouverez ci-dessous un bref aperçu des tissus cérébraux congelés pour les stocker en vue d’une utilisation ultérieure.

1. Prélèvement et stockage des tissus cérébraux : Disséquez le cerveau de souris et récoltez rapidement les régions chargées d’amyloïde (cortex et hippocampe), puis congelez-les instantanément dans de l’azote liquide ou dans un bain d’alcool cryogénique.
   note: La congélation instantanée aide à préserver les attributs structurels des constituants du tissu. Les souris sont euthanasiées par isoflurane et luxation cervicale. Il est conseillé d’éviter d’utiliser du CO₂ car cela peut compromettre l’intégrité du protéome cérébral.
2. Après la dissection, coupez et stockez les tissus frais en petits blocs (p. ex., 5 mm x 5 mm), car cela facilite une homogénéisation plus efficace avant l’extraction amyloïde. Transférez le tissu dans le flacon cryogénique stérile, serrez son capuchon et immergez-le rapidement.
3. Conservez les tissus congelés dans des conditions ultra-froides (c.-à-d. -80 °C ou azote liquide). Si l’extraction doit être effectuée quelques jours plus tard, conservez les tissus à -20 °C et évitez les cycles de congélation et de décongélation. Décongelez les tissus congelés sur de la glace humide lorsqu’ils sont prêts pour l’extraction et la purification.
   note: Le contact direct des tissus avec de l’azote liquide peut causer des dommages aux tissus et aux protéines. Notez qu’un bain d’alcool peut enlever les marqueurs permanents des étiquettes des tubes.

2. Enrichissement d’une matière insoluble au dodécylsulfate de sodium (SDS)

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes sur glace et centrifugez à 4 °C, sauf indication contraire. Les fabricants et les numéros de catalogue des produits chimiques et des instruments sont fournis dans la table des matériaux.

1. Commencez par placer des régions de tissu cérébral fraîchement disséquées ou congelées (décongelées sur de la glace) dans un tube de 2 ml contenant 6 à 8 billes de céramique et un tampon d’homogénéisation glacé fraîchement préparé (1 ml pour 0,25 à 1 g de masse tissulaire humide).
2. Transférez les tubes dans l’homogénéisateur du broyeur à billes et broyez le contenu des tissus à 4000 tr/min, avec deux cycles de 30 s chacun et un intervalle de 30 s entre les deux.
   note: Alternativement, des systèmes d’agitateur ou d’homogénéisateur motorisés peuvent être utilisés pour broyer et homogénéiser les tissus.
3. Ajouter 9 mL de tampon d’homogénéisation glacé à 1 mL d’homogénat de tissu entier du cerveau dans des tubes de 15 mL, sceller avec des bandes de film de cire de laboratoire et tourner d’un bout à l’autre pendant la nuit à 4 °C pour assurer une solubilisation robuste.
   note: Pour éliminer les gros débris cellulaires et les lipides indésirables, le lendemain matin, faites tourner les tubes à 800 x g à 4 °C pendant 10 min et recueillez le surnageant dans un tube frais. Remettre en suspension la pastille restante dans 2 mL de tampon d’homogénéisation glacé, bien mélanger, tourner à nouveau pendant 10 minutes à 4 °C et mélanger les deux surnageants.
4. Ajouter lentement du saccharose solide à la suspension d’extrait de tissu jusqu’à une concentration finale de 1,2 M, bien mélanger et centrifuger à 250 000 x g pendant 45 min à 4 °C.
5. Retirez et jetez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette. Remettre la pastille en suspension dans 2 mL de tampon d’homogénéisation contenant 1,9 M de saccharose par trituration, suivie d’une centrifugation à 125 000 x g pendant 45 min à 4 °C
   note: Le volume du tampon peut être ajusté en fonction de la quantité de matériau récupérée à l’étape précédente. En général, 10 volumes de tampon d’homogénéisation (V/V) sont idéaux pour cette étape.
6. Prélever la couche solide blanche supérieure à l’aide d’une pipette, la transférer dans un tube frais et la solubiliser dans 1 mL de tampon de lavage glacé en pipetant de haut en bas plusieurs fois, sans introduire de bulles d’air.
7. Outre la couche supérieure, le granulé est également enrichi de fibrilles amyloïdes. Pour un rendement plus élevé, combinez les deux fractions et continuez. Retirez délicatement la couche aqueuse intermédiaire à l’aide d’une pipette et jetez-la.
8. Centrifuger les fractions combinées à 8000 x g pendant 20 min à 4 °C. Jeter le surnageant.
9. Ajouter 1 mL de tampon de digestion glacé à la pastille lavée, remettre en suspension et incuber à température ambiante (RT) pendant 3 h.
10. Centrifuger à 8000 x g pendant 20 min à 4 °C et prélever le surnageant à l’aide d’une pipette.
11. Remettre en suspension et laver (comme à l’étape 2.8) la pastille digérée deux fois dans 1 mL de tampon Tris glacé.
12. Remettre la pastille lavée en suspension dans 1 mL de tampon de solubilisation contenant 1 % de SDS et 1,3 M de saccharose en le pipetant de haut en bas. Centrifugeuse rapide à 200 000 x g pendant 60 min à 4 °C.
    note: Bien que les fibrilles amyloïdes soient très résistantes aux détergents et aux dénaturants, des expositions très longues au détergent (1 % de SDS) peuvent affecter l’intégrité des fibrilles ou éliminer les protéines étroitement liées, ce qui compromettra les analyses ultérieures. Par conséquent, immédiatement après la remise en suspension des granulés, procédez à la centrifugation.
13. Conservez la pastille et augmentez le volume du surnageant restant en ajoutant 50 mM de tampon Tris (dans un rapport de 1:0,3) pour réduire la concentration de saccharose de 1,3 à 1 M et centrifugez une fois de plus à 200 000 x g pendant 45 min à 4 °C.
14. Dissoudre les deux pastilles dans 100 μL de tampon Tris contenant 0,5 % de SDS et de pool pour la purification de l’amyloïde. Les granules visibles sont petites et doivent apparaître opaques et blanc cassé (voir figure 1A).

Résultats

Figure 1 : Confirmation de l’extraction de l’amyloïde par coloration biochimique et imagerie des fibrilles amyloïdes. (A) La pastille insoluble SDS enrichie contenant de l’amyloïde apparaît opaque de couleur blanc cassé. (B) coloration au rouge Congo du surnageant soluble SDS et des pastilles insolubles SDS contenant de l’amyloïde purifiée par transfert sur un...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Protéase inhibitrice	Thermo Scientific	164535	Des instruments, des produits chimiques et des anticorps alternatifs d’autres fabricants peuvent être utilisés
Chlorure de calcium	Sigma-Aldrich	Réf. C1016	Des instruments, des produits chimiques et des anticorps alternatifs d’autres fabricants peuvent être utilisés
Collagènase	Sigma-Aldrich	C0130	Des instruments, des produits chimiques et des anticorps alternatifs d’autres fabricants peuvent être utilisés
Cocktail complet d’inhibiteurs de protéase	Sigma-Aldrich	11697498001	Des instruments, des produits chimiques et des anticorps alternatifs d’autres fabricants peuvent être utilisés
Dnase I	Thermo Fisher Scientific	La norme EN0521	Des instruments, des produits chimiques et des anticorps alternatifs d’autres fabricants peuvent être utilisés
Moteur du système d’homogénéisation des tissus K54	Cole Parmer	Glas-Col 099C	Des instruments, des produits chimiques et des anticorps alternatifs d’autres fabricants peuvent être utilisés
Ultracentrifugeuse Optima L-90K	Beckman Coulter	BR-8101P-E	Des instruments, des produits chimiques et des anticorps alternatifs d’autres fabricants peuvent être utilisés
Homogénéisateur de tissus Precellys 24	Bertin Instruments	P000062-PEVO0-A	Des instruments, des produits chimiques et des anticorps alternatifs d’autres fabricants peuvent être utilisés
Dodécylsulfate de sodium (FDS)	Sigma-Aldrich	Référence 74255	Des instruments, des produits chimiques et des anticorps alternatifs d’autres fabricants peuvent être utilisés
Microcentrifugeuse Sorvall Legend Micro 21R	Thermo Fisher Scientific	75002446	Des instruments, des produits chimiques et des anticorps alternatifs d’autres fabricants peuvent être utilisés
Tris-HCl	Thermo Fisher Scientific	15568025	Des instruments, des produits chimiques et des anticorps alternatifs d’autres fabricants peuvent être utilisés