Injection intra-ventriculaire intra-ventriculaire pour analyser la distribution du cytomégalovirus murin dans le cerveau d’une souris néonatale

Résumé

Source : Kawasaki, H., et al. Injection intravasculaire intraventriculaire et intravasculaire de particules virales et de microbilles fluorescentes dans le cerveau néonatal. J. Vis. Exp. (2016).

Cette vidéo montre le processus d’injection intraventriculaire pour étudier la distribution du cytomégalovirus murin (MCMV) dans le cerveau de souris néonatale. La MCMV, conçue pour exprimer une protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) pour la visibilité, est injectée dans le ventricule latéral du cerveau d'un bébé souris. Le virus injecté circule dans le liquide céphalo-rachidien, infectant les cellules de la région périventriculaire, y compris la zone marginale, le plexus choroïde et la zone sous-ventriculaire.

Protocole

1. Injection ICV de MCMV et de microbilles fluorescentes chez des souris néonatales

1. Maintenez les souris ICR enceintes normales dans un établissement à température contrôlée sous un cycle lumière/obscurité de 12 heures. Les nouveau-nés sont désignés comme P 0,5 le jour de la naissance.
2. Stérilisez une seringue de 10 μl et une aiguille de 27 g avec de l’alcool à 70 %.
3. Chargez la solution d’injection (5 μl) contenant du MCMV ou des microbilles fluorescentes dans l’aiguille en tirant délicatement sur le piston de la seringue.
4. Maîtriser la souris nouveau-née (P 0,5) en la mettant sur de la glace pendant 3 à 4 min. Une fois que l’animal est sous anesthésie, utilisez la méthode de réponse par pincement des orteils pour déterminer la profondeur de l’anesthésie.
5. Marquez le point d’injection à l’aide d’un enclos de laboratoire non toxique à un endroit situé à environ 0,7 à 1,0 mm sur le côté de la suture sagittale et à 0,7 à 1,0 mm sur le côté caudal du petit déjeuner néonatal (figure 1A).
6. Insérez l’aiguille à une profondeur de 2 mm, perpendiculairement à la surface du crâne au site d’injection marqué. À titre de référence, marquez à 2 mm de la pointe de l’aiguille avec un fabricant non toxique.
7. Injecter lentement 5 μl de MCMV (environ 5 × 10⁵ PFU) dans le ventricule latéral sans ouvrir le cuir chevelu (Figure 1B).
8. Dans un autre groupe de souris, injecter une solution de 5 μl contenant des microbilles fluorescentes (0,1 - 0,3 μm, environ 5,75 × 10⁸ particules) par la même méthode.
9. Retirez lentement l’aiguille 10 à 20 secondes après avoir interrompu le mouvement du piston pour éviter le reflux.
10. Pour récupérer, conservez les souris pendant 5 à 10 minutes dans un récipient chaud jusqu’à ce que le mouvement et la réactivité générale soient rétablis.
11. Prélever les cerveaux à différents moments (3, 12, 24, 48 et 72 heures) après l’injection.

Résultats

Figure 1 : Sites d’injection de la souris néonatale. (A, B) Injection par ICV de 5 μl de MCMV (environ 5 × 10⁵ PFU) ou de 5 μl de microbilles (environ 5,75 × 10⁹ particules). (A) Le site d’injection se trouve au point médian entre l’oreille et l’œil (à un endroit d’environ 0,7 à 1,0 mm latéralement par rapport à la suture sagittale et à 0,7 à 1,0 mm cauda...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
SPHERO TM Polystyrène fluorescent Rouge du Nil 0.04-0.06	Spherotech, Inc.	Réf. : FP-00556-2
SPHERO TM Polystyrène fluorescent Rouge du Nil 0.1-0.3	Spherotech, Inc.	Réf. : FP-0256-2
SPHERO TM Polystyrène fluorescent Rouge du Nil 1.7-2.2	Spherotech, inc.	Réf. FP-2056-2
10 % sérum de souris	DAKO	X0910
Souris C57BL/6	SLC, Inc.
Souris ICR	SLC, Inc.
Seringues de microlitre modifiées (série 7000)	Entreprise Hamilton
Aiguille de calibre 35	Saito Medical
vecteur pEGFP-N1	Clontech	Réf. #6085-1