Évaluation de la réponse interneuronale aux signaux chimioattractifs des cellules endothéliales périventriculaires

Résumé

Source : Datta, D., et al. Tests de migration, de chimio-attraction et de co-culture pour les cellules endothéliales dérivées de cellules souches humaines et les neurones GABAergiques. J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo montre une méthode pour tester la migration des interneurones en réponse à des signaux chimioattractifs provenant de cellules endothéliales périventriculaires (PVEC). Les interneurones sont placés dans un compartiment central, avec des PVEC et des cellules de contrôle de chaque côté. L’augmentation de la migration vers les PVEC indique une réponse positive à leurs signaux chimioattractifs.

Protocole

1. Essai de chimio-attraction

1. Placez un insert de culture à trois puits au centre d’une boîte de 35 mm recouverte de poly-L-ornithine/laminine à l’aide d’une pince à épiler stérile.
2. Retournez le plat. Marquez la limite autour du compartiment central de l’insert à l’aide d’un marqueur noir permanent avec une pointe ultra-fine.
3. Grainez 3 x 10⁴ interneurones GABAergiques humains dans le compartiment central dans 70 μL de milieu neuronal (Figure 1A).
4. Ensemencez 10⁴ cellules endothéliales périventriculaires humaines dans 70 μL de milieu de cellules endothéliales périventriculaires et 10⁴ cellules endothéliales de contrôle dans 70 μL de milieu de cellules endothéliales de contrôle dans les deux compartiments externes, respectivement (Figure 1A).
5. Ajouter 1 mL de milieu de co-culture (50 % de milieu d’entretien périventriculaire sans GABA et 50 % de milieu neuronal) sur le côté de la boîte pour empêcher le revêtement de la boîte de sécher.
6. Vérifiez au microscope que les cellules ne fuient pas du compartiment d’insertion.
7. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C et 5 % de CO₂. Après 24 h d’incubation, vérifiez au microscope que les cellules se sont bien fixées et qu’il n’y a pas de fuite.
8. Après 48 h de semis, retirez délicatement l’insert à l’aide d’une pince à épiler stérile. Vérifiez au microscope que la couche cellulaire n’est pas perturbée (jour 0).
9. Retirer le milieu et ajouter 1 mL de milieu de coculture frais.
   REMARQUE : Réservez un nombre requis de plats pour les images du jour 0.
10. Incuber les cellules pendant 36 h à 37 °C et 5 % de CO₂. Après 36 h, aspirez le milieu, fixez les cellules avec 4 % de PFA pendant 10 min et lavez-les 3 fois avec 1 fois le PBS.
11. Tache les interneurones GABAergiques humains avec une β-tubuline humaine ou un anticorps MAP2 humain. À la fin de la procédure de coloration, ajoutez 1 mL de produit de montage antifade dans chaque plat.

2. Imagerie et analyse des données

1. Placez la boîte de test immuno-colorée sous un microscope à un grossissement de 4X.
2. Gardez un bord long de la bordure rectangulaire (effectué à l’étape 5.10 ci-dessus) dans le champ de vision. Prenez des images des cellules dans l’espace libre adjacent à cette limite. Acquisition d’images le long du bord long droit et du bord long gauche de la bordure rectangulaire.
   REMARQUE : Les cellules positionnées en diagonale par rapport au rectangle ne sont pas prises en compte en raison de l’ambiguïté dans la sélection du bord court ou long comme marque de départ. De plus, le nombre de cellules migrant à travers le bord court est souvent significativement inférieur (peut-être en raison d’un nombre inférieur de cellules de départ le long du bord court) et n’est pas pris en compte.
3. Ouvrez les images dans ImageJ. Calculez la distance entre chaque cellule et la borne à l’aide d’ImageJ.
4. Pour évaluer la migration en termes de nombre de cellules, définissez une distance spécifique par rapport à la limite dans l’image acquise dans ImageJ. Comptez le nombre de cellules présentes à cette distance. Calculer nombre moyen, devia standard
5. et la signification statistique à l’aide d’un logiciel approprié.

Résultats

Figure 1 : Test de chimio-attraction. (A) Schéma du test de chimio-attraction. À l’aide d’un insert de culture à trois puits, les interneurones (IN) ont été ensemencés au milieu (rectangle pointillé vert), tandis que les cellules endothéliales périventriculaires (EC PV ; rectangle pointillé orange) et les cellules endothéliales témoins (EC ; rectangle pointillé jaune) ont été ensemencées de ch...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Contrôler les cellules endothéliales humaines	Dynamique cellulaire	Réf. R1022
Cellules endothéliales de contrôle Medium Supplement	Dynamique cellulaire	Référence M1019
DMEMF/12 moyen	Thermofisher Scientific	11320033
E6 moyen	Thermofisher Scientific	A1516401
FGF2	Thermofisher Scientific	PHG0261
Fibronectine	Thermofisher Scientific	Référence 33016-015
Le GABA	Sigma-Aldrich	A2129
Hémacytomètre	Sigma-Aldrich	Z359629
Neurones GABAergiques humains	Dynamique cellulaire	R1013
Neurones GABAergiques humains milieu de base	Dynamique cellulaire	Référence M1010
Neurone GABAergique humain Supplément neuronal	Dynamique cellulaire	Référence M1032
Laminine	sigma	L2020
Support de montage	Laboratoires de vecteurs	H-1200
poly-L-ornithine	sigma	p4957 (traduction libre
Pbs	Thermofisher Scientific	Référence 14190
VEGF-A	Peprotech	100-20
Kit complet VascuLife VEGF Medium	Technologies de cellules Lifeline	LL-0003	Composant du milieu de cellules endothéliales humaines témoins
Culture en silicone à 3 puits-Insert	Ibidi	Référence 80369
Plat de 35 mm	Corning	430165
Solution de PFA à 4 %	Fisher Scientific	AAJ19943K2
Microscope à contraste de phase inversé	Zeiss	Zeiss Axiovert 40C
Microscope fluorescent	Olympe	FSX-100
Anticorps anti-tubuline β humaine	Biolégende	802001
Anticorps anti-MAP2	Névromique	CH22103