REMARQUE : L’eau distillée et désionisée autoclavée (ddH2O) est recommandée pour la fabrication de tampons et de mélanges maîtres de réaction.
1. Collecte et réticulation des cellules
- Après avoir différencié les cellules souches embryonnaires (SE) de souris en neurones postmitotiques, ajoutez 11 % de formaldéhyde aux cellules récoltées jusqu’à une concentration finale de 1 % (v/v). Cellules de roche sur une plate-forme à bascule (bascule, agitateur ou rotateur) pendant 15 min, à température ambiante (RT, 25 °C).
note: Selon la protéine cible à réticuler, une réticulation moins de formaldéhyde (par exemple, une concentration finale de 0,5 %) ou une double réticulation avec du glutarate de disuccinimidyle (DSG) peut être utilisée.
- Ajouter 2,5 M de glycine à une concentration finale de 150 mM pour arrêter la réaction de réticulation. Cellules de roche sur une plate-forme basculante à RT, pendant 5 min.
- Centrifuger les cellules réticulées dans des tubes coniques de 15 mL à RT, pendant 6 min, à 1 350 x g. Aspirez la solution, puis mettez les cellules en suspension dans 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
note: Les granulés de cellules réticulées peuvent être stockés à -80 °C après congélation instantanée avec de l’azote liquide.
2. Lyse cellulaire
REMARQUE : Les étapes suivantes de ce protocole concernent environ 2 x 107 cellules neuronales différenciées des cellules ES de souris. Pour briser les cellules ouvertes, des tampons de lyse contenant divers détergents seront utilisés. Ajouter 50 μL de 1000 inhibiteurs de protéase complets (IPC) à 50 mL de tampon juste avant l’utilisation.
- Préparez les tampons de lyse 1 à 3 comme décrit dans le tableau 1.
- Décongelez les pastilles de cellules réticulées sur de la glace, puis remettez complètement en suspension les pastilles de cellules dans 3 ml de tampon de lyse 1 dans des tubes coniques de 15 ml. Basculez-vous à 4 °C pendant 15 min sur une plate-forme basculante. Centrifuger à 1 350 x g pendant 5 min à 4 °C et aspirer le surnageant.
- Remettez soigneusement en suspension les cellules granulées dans 3 mL de tampon de lyse 2. Basculez-vous à 4 °C pendant 10 min sur une plate-forme basculante. Centrifuger à 1 350 x g pendant 5 min à 4 °C et aspirer le surnageant.
- Ajouter 1 mL de tampon de lyse 3 à chaque pastille, puis conserver sur de la glace. Passez immédiatement à la sonication.
3. Chromatine sonicante
REMARQUE : Conservez les échantillons sur de la glace ou à 4 °C pendant cette procédure de sonication pour réduire l’inversion de réticulation.
- À l’aide d’une spatule stérile, ajoutez des billes de sonication (Table des matières) jusqu’à la graduation de 0,2 mL sur les tubes de polystyrène de 15 mL. Lavez les billes de sonication en les faisant tourbillonner dans 600 μL de 1x PBS jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de points secs visibles. Centrifuger les tubes pendant 5 s à 30 x g et aspirer 1x PBS.
note: La sonication dans les tubes en polystyrène est plus efficace que la sonication dans les tubes en polypropylène. Si un plus petit nombre de cellules (par exemple, <106 cellules) est soniquée, utilisez des tubes de polystyrène de 1,5 ml sans ajouter de billes de sonication.
- Remettre complètement les lysats nucléaires en suspension dans 1 mL de tampon de lyse 3 (à partir de l’étape 2.4), puis transférer dans les tubes de polystyrène de 15 mL contenant des billes de sonication. Vortex brièvement les tubes de polystyrène.
- Pour fragmenter l’ADN de la chromatine réticulé, le nucléaire de sonicate lysat à 4 °C pour un nombre optimisé de cycles, avec une amplitude de puissance à 30 W et des cycles de sonication réglés à 30 s marche/30 s arrêt.
note: L’optimisation de la sonication pour chaque type de cellule et chaque lot permettra d’obtenir le meilleur rendement d’immunoprécipitation-exonucléase de la chromatine (ChIP-exo). Pour 2 x 107 cellules neuronales de souris, 20 à 30 cycles de sonication aux paramètres mentionnés fragmenteront la chromatine dans la gamme de 100 à 500 pb.
- Une fois la sonication terminée, transférez tous les surnageants (lysats soniqués) de chaque échantillon dans des tubes de 1,5 ml. Ajouter 10 % de 2-[4-(2,4,4-triméthylpentan-2-yl)phénoxy]éthanol) à chaque échantillon à une concentration finale de 1 %. Mélanger par pipetage.
- Pour granuler les débris cellulaires, centrifugez les échantillons à 13 500 x g pendant 10 min à 4 °C. Transférez tous les lysats soniqués (surnageant) de chaque échantillon dans de nouveaux tubes de 1,5 mL.
- Prélever 30 μL de lysat soniqué de chaque échantillon (~3 % de lysat soniqué) et l’ajouter dans de nouveaux tubes de 1,5 mL pour vérifier la sonication. Stocker les lysats soniqués restants à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’incubation avec des billes enrobées d’anticorps.
4. Vérification de la sonication
- Préparez 20 ml de tampon 2x protéinase K en ajoutant 2 ml de Tris-HCl 0,5 M (pH 8,0), 2 ml d’acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA) 0,5 M, 10 ml de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 10 % et 6 ml de ddH2O autoclave. N’ajoutez pas l’IPC à cette mémoire tampon. Conserver dans un tube de 50 mL à RT.
- Pour inverser la réticulation protéine-ADN, en retirant les protéines, prélever les 30 μL de chromatine soniquée de chaque échantillon (à l’étape 3.6), ajouter 166 μL de ddH2O autoclave, 200 μL de tampon 2x protéinase K et 4 μL de 20 mg/mL de protéinase K. Agiter brièvement les échantillons, puis incuber à 65 °C pendant 1−3 h à 24 x g.
- REMARQUE : Les lysats soniqués peuvent être réticulés à 65 °C pendant la nuit.
- Extrayez l’ADN à l’aide de la méthode de précipitation phénol :chloroforme :isoamylique (PCIA : 25:24:1) et de la méthode de précipitation à l’éthanol comme suit.
prudence: L’ICP est toxique. À utiliser sous une hotte avec un équipement de protection individuelle (EPI) standard.
- Ajoutez 400 μL de PCIA à chaque échantillon dans des tubes de 1,5 mL, réglez le vortex à la vitesse maximale et les échantillons de vortex pendant 20 s. Centrifugeuse à 18 400 x g pendant 6 min à RT. Deux phases seront observées. Transférez soigneusement la couche aqueuse supérieure (phase claire) de chaque échantillon dans de nouveaux tubes de 1,5 ml.
- Ajouter 1 μL de RNase A à 10 mg/mL. Incuber les échantillons à 37 °C pendant 30 min.
- Ajouter 1 μL de glycogène à 20 mg/mL dans chaque échantillon, puis précipiter avec 1 mL d’éthanol 100 % glacé (stocké dans un congélateur à -20 °C). Mélanger brièvement, puis incuber les échantillons au congélateur à -80 °C pendant 30 min à 1 h. Centrifugez les échantillons à 18 400 x g pendant 10 min à 4 °C et versez soigneusement de l’éthanol à 100 %.
- Lavez les granulés avec 500 μL d’éthanol glacé à 70 % (stocké dans un congélateur à -20 °C). Centrifuger à 18 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Verser délicatement de l’éthanol à 70 %.
- Incuber les échantillons dans des tubes de 1,5 mL à 50 °C jusqu’à ce que l’éthanol restant soit évaporé. Mettez à nouveau en suspension des pastilles d’ADN dans 15 μL de ddH2O autoclavé ou de ddH2O sans nucléase.
- Analysez les échantillons d’ADN extraits, ainsi qu’une échelle d’ADN, dans un gel d’agarose à 1,5 % à 120-180 V et vérifiez la taille de l’ADN soniqué.
5. Incubation d’anticorps avec des billes
REMARQUE : Les étapes suivantes de ce protocole concernent environ 2 x 107 cellules neuronales différenciées des cellules ES de souris. Ne congelez pas et ne décongelez pas les billes magnétiques à aucun moment pendant le protocole ChIP-exo, car elles pourraient se fissurer, contaminer l'échantillon ou compromettre les performances de l'anticorps.
- Après la lyse cellulaire et la sonication, préparer des billes magnétiques de protéine G (Table des matériaux) pour ChIP, mélanger les billes magnétiques jusqu’à ce qu’elles soient homogènes, puis ajouter 25 μL de billes magnétiques à 2 mL de tubes à faible liaison protéique.
REMARQUE : Le type de billes magnétiques utilisées dépendra de l’espèce des anticorps.
- Lavez les billes avec 1 mL de solution de blocage (tableau 1), mélangez bien, puis placez-les sur une grille magnétique pendant 1 min. Toujours sur une grille magnétique, retirez le surnageant une fois qu’il est dégagé.
- Ajouter 1 mL de solution de blocage aux billes magnétiques. Tubes de roche pendant 10 min à 4 °C sur une plate-forme basculante. Tournez brièvement, puis placez les tubes sur une grille magnétique et retirez le surnageant.
- Répétez l’étape 5.3 deux fois de plus.
- Ajouter 500 μL de solution de blocage aux billes magnétiques. Faites brièvement tourner l’anticorps contre Isl1 (0,04 μg/μL, tableau des matériaux), puis ajoutez 4 μg d’anticorps dans des tubes à faible liaison protéique correspondants de 2 mL contenant les billes magnétiques dans une solution bloquante.
- Répétez l’étape 5.5 sans anticorps (c’est-à-dire le contrôle sans anticorps pour ChIP).
note: La quantité d’anticorps à ajouter peut être déterminée empiriquement en tenant compte de la qualité de l’anticorps et du nombre de cellules utilisées pour la ChIP.
- Échantillons de roche à 4 °C pendant 6 à 24 h sur une plate-forme à bascule.
6. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)
- Lavez les billes recouvertes d’anticorps de l’étape 5.8 avec 1 mL de solution bloquante. Placer les échantillons sur une plate-forme basculante à 4 °C pendant 5 min. Retirer le surnageant.
- Répétez l’étape 6.1 deux fois de plus.
- Remettre en suspension les billes enrobées d’anticorps dans 50 μL de solution bloquante, puis transférer dans de nouveaux tubes à faible liaison protéique de 2 mL. Pour chaque échantillon de ChIP, ajoutez des lysats soniqués (~1,0 mL à partir de l’étape 3.6) à des billes enrobées d’anticorps dans des tubes à faible liaison protéique de 2 mL.
- Incuber chaque échantillon sur une plate-forme à bascule pendant la nuit à 4 °C.
7. Lavages ChIP
REMARQUE : Conservez les échantillons sur de la glace ou à 4 °C pour maintenir la réticulation protéine-ADN pendant les lavages ChIP.
- Préparez un tampon de lavage à haute teneur en sel, un tampon de lavage LiCl et un tampon Tris-HCl de 10 mM (pH 7,4) comme décrit dans le tableau 2. Conserver dans des tubes de 50 mL à 4 °C. Ajouter 50 μL de stock 1000x CPI à tous les tampons juste avant utilisation.
- Faites tourner brièvement les échantillons dans des tubes à faible liaison protéique de 2 mL pour recueillir le liquide des capuchons, puis placez-les sur une grille magnétique pendant 1 min et retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette.
- Pour les lavages ChIP, ajoutez 1 mL de tampon de lyse 3 (à 4 °C) dans chaque tube. Mélanger sur une plate-forme à bascule à 4 °C pendant 5 min. Faites tourner brièvement les échantillons, puis placez-les sur un support magnétique pendant 1 minute et retirez le surnageant à l’aide d’une pipette.
- Ajouter 1 mL de tampon de lavage froid à haute teneur en sel dans chaque tube. Mélanger sur une plate-forme à bascule à 4 °C pendant 5 min. Faites tourner brièvement les échantillons, puis placez-les sur un support magnétique pendant 1 min et retirez le surnageant à l’aide d’une pipette.
- Ajouter 1 mL de tampon de lavage LiCl froid dans chaque tube. Mélanger sur une plate-forme à bascule à 4 °C pendant 5 min. Faites tourner brièvement les échantillons, puis placez-les sur un support magnétique pendant 1 min et retirez le surnageant à l’aide d’une pipette.
- Ajouter 1 mL de tampon Tris-HCl froid de 10 mM (pH 7,4) dans chaque tube. Mélanger sur une plate-forme à bascule à 4 °C pendant 5 min. Faites tourner brièvement les échantillons, puis placez-les sur un support magnétique pendant 1 min et retirez le surnageant à l’aide d’une pipette.
note: Le tampon Tris-EDTA (pH 8,0) peut être utilisé à la place du tampon Tris-HCl (pH 7,4).
Tableau 1 : Recettes pour les tampons de lyse 1−3 et le tampon de blocage. Conserver dans des tubes de 50 mL à 4 °C. Ajouter 50 μL de 1000x CPI (inhibiteur complet de protéase) à tous les tampons juste avant l’utilisation.
| Tampon de lyse 1 |
| Réactif | Contenance (mL) | [Finale] |
| 1 M HEPES (pH 7,3) | 2.5 | 50 millions d’euros |
| 5 M NaCl | 1.4 | 140 millions de mètres |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0,1 | 1 million d’euros |
| 50 % de glycérol | 10 | 10 % |
| 10 % d’éthoxylate d’octylphénol | 2.5 | 0,50 % |
| 10 % de 2-[4-(2,4,4-triméthylpentan-2-yl)phénoxy]éthanol | 1,25 | 0,25 % |
| Autoclave ddH2O | Remplir jusqu’à 50 | |
| Tampon de lyse 2 |
| Réactif | Contenance (mL) | [Finale] |
| 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) | 1 | 10 millions d’euros |
| 5 M NaCl | deux | 200 millions d’euros |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0,1 | 1 million d’euros |
| Autoclave ddH2O | Remplir jusqu’à 50 | |
| Tampon de lyse 3 |
| Réactif | Contenance (mL) | [Finale] |
| 1 M de Tris-HCl (pH 8,0) | 0,5 | 10 millions d’euros |
| 5 M NaCl | 1 | 100 millions d’euros |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0,1 | 1 million d’euros |
| 10 % d’acide désoxycholique | 0,5 | 0,10 % |
| Solution de sel de sodium de N-Lauroylsarcosine à 30 % | 0,83 | 0,50 % |
| Autoclave ddH2O | Remplir jusqu’à 50 | |
| Solution de blocage |
| Réactif | quantité | [Finale] |
| Albumine sérique bovine (BSA) | 250 mg | 0,50 % |
| Inhibiteur complet de la protéase (CPI, 1000x) | 50 μL | 1x |
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | Remplissage à 50 mL | |
Tableau 2 : Recettes pour les lavages ChIP : tampon de lavage à haute teneur en sel, tampon de lavage LiCl et tampon Tris-HCl 10 mM (pH 7,4). Conserver dans des tubes de 50 mL à 4 °C. Ajouter 50 μL de stock 1000x CPI à tous les tampons juste avant utilisation.
tampon de lavage
| Tampon de lavage à haute teneur en sel |
| Réactif | Contenance (mL) | [Finale] |
| 1 M HEPES (pH 7,3) | 2.5 | 50 millions d’euros |
| 5 M NaCl | 5 | 500 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0,1 | 1 million d’euros |
| 10 % de 2-[4-(2,4,4-triméthylpentan-2-yl)phénoxy]éthanol | 5 | 1 % |
| Acide désoxycholique à 5 % | 1 | 0,10 % |
| 5 % FDS | 1 | 0,10 % |
| Autoclave ddH2O | Remplir jusqu’à 50 | |
| LiCl |
| Réactif | Contenance (mL) | [Finale] |
| 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) | deux | 20 millions d’euros |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0,1 | 1 million d’euros |
| 1 M LiCl | 12,5 | 250 millions d’euros |
| 10 % d’éthoxylate d’octylphénol | 2.5 | 0,50 % |
| Acide désoxycholique à 5 % | 5 | 0,50 % |
| Autoclave ddH2O | Remplir jusqu’à 50 | |
| 10 mM Tampon Tris-HCl |
| Réactif | Contenance (mL) | [Finale] |
| 1 M de Tris-HCl (pH 7,4) | 0,5 | 10 millions d’euros |
| Autoclave ddH2O | Remplir jusqu’à 50 | |
