Immunomarquage par fluorescence de tranches d’organoïdes cérébelleux

Résumé

Source : Silva, T. P., et al., Génération évolutive d’organoïdes cérébelleux matures à partir de cellules souches pluripotentes humaines et caractérisation par immunomarquage. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo démontre la coloration par immunofluorescence de tranches d’organoïdes cérébelleux pour identifier des antigènes cibles spécifiques exprimés dans divers neurones cérébelleux, qui sont indicatifs de la maturation des organoïdes.

Protocole

1. Immunocoloration de tranches d’organoïdes

1. Placez les lames de microscope contenant des coupes organoïdes dans un bocal contenant 50 ml de PBS 1x préchauffé, en contenant jusqu’à 10 lames dos à dos.
   note: Toutes les sections d’organoïdes doivent être immergées dans un liquide.
2. Incuber pendant 45 min à 37 °C pour dégélatiniser les lames.
3. Laver 1 fois avec 50 ml de PBS 1× pendant 5 min à RT : Transférer les lames dans un bocal contenant du PBS frais 1×.
4. Transférez les lames dans un bocal contenant 50 ml de glycine fraîchement préparée (tableau 1) et incubez pendant 10 min à RT.
5. Transvaser les lames dans un bocal contenant 50 mL de triton à 0,1 % (tableau 1) et perméabiliser pendant 10 minutes à RT.
6. Laver avec 1× PBS pendant 5 min 2x.
7. Préparez la boîte d’immunocoloration avec du papier de 3 mm imbibé de 1× de PBS. Séchez les lames avec un mouchoir tout autour des tranches et placez-les sur du papier de 3 mm. À l’aide d’une pipette Pasteur, recouvrez toute la surface des lames d’une solution bloquante (tableau 1), à raison de 0,5 mL par lame. Incuber pendant 30 min à RT.
8. Retirez l’excès de solution bloquante et séchez les lames avec un mouchoir tout autour des tranches. Placer 50 μL de l’anticorps primaire (tableau 2) dilué dans une solution bloquante sur les sections et couvrir avec les lamelles. Placez les tranches dans une boîte d’immunomarquage préalablement préparée. Incuber toute la nuit à 4 °C.
9. Transférez les lames dans un bocal avec 50 ml de TBST (tableau 1), laissez tomber les lamelles et lavez-les avec du TBST pendant 5 min 3x.
10. Placer 50 μL de l’anticorps secondaire dilué dans une solution bloquante sur les sections et couvrir avec les lamelles. Placez les tranches dans la boîte d’immunomarquage préalablement préparée. Incuber pendant 30 min à RT, à l’abri de la lumière.
11. Transférez à nouveau les lames dans un bocal et lavez-les avec 50 ml de TBST pendant 5 minutes 3x.
12. Séchez les lames avec un mouchoir tout autour des tranches et placez les tranches dans une boîte d’immunocoloration préalablement préparée. À l’aide d’une pipette Pasteur, ajoutez 0,5 mL de solution DAPI sur toute la surface des lames. Incuber pendant 5 min à RT.
13. Répétez l’étape 1.9.
14. Séchez soigneusement les lames avec un mouchoir en papier. Ajoutez 50 μL de support de montage goutte à goutte le long de la lame, puis abaissez soigneusement une lamelle sur chaque lame, en la pliant légèrement pour éviter les bulles.

Tableau 1 : Solutions pour la préparation d’organoïdes pour la cryosection et l’immunomarquage. Vous trouverez la liste de tous les composants et volumes utilisés pour préparer les solutions utilisées dans la préparation des organoïdes pour la cryosection et l’immunomarquage.

Gélatine/Saccharose Concentration finale : 7,5 %/15 % p/p	1. Pesez 15 g de saccharose et 7,5 g de gélatine dans une bouteille en verre Schott stérile et mélangez bien 2. Préchauffez le PBS 1x à 65 °C 3. Ajoutez du PBS 1x préchauffé pour un poids final de 100 g et mélangez bien 4. Placez la bouteille en verre Schott dans une plaque chauffante à 65 °C et secouez-la jusqu’à ce que la gélatine fonde 5. Incuber à 37 °C jusqu’à ce que la solution se stabilise
Glycine Concentration finale : 0,1 M	Ajouter 0,37 g de glycine à 50 ml de PBS 1x fraîchement préparé.
Triton solution Concentration finale : 0,1 % p/v	1. Préparez un bouillon Triton X-100 à 10 % : 5 g de Triton X-100 dans 50 mL de PBS 1x 2. Ajoutez 0,5 mL de stock Triton X-100 à 50 mL de PBS 1x.
TBST 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,05 % p/v Tween-20	20 mL Tris 1 M 30 mL de NaCl 5 M 5 mL de Tween-20 (10 % de matière première : 5 g de Tween-20 dans 50 mL d’eau) Remplissez à 1 L d’eau.
Solution de blocage	Ajouter 5 mL de sérum fœtal bovin (FBS, concentration finale : 10 % v/v) à 50 mL de TBST.
La solution DAPI	Ajouter 15 μL de solution mère de DAPI (1 mg/mL) à 10 mL d’eau distillée
Mowiol	1. Ajouter 2,4 g de Mowiol à 6 g de glycérol et agiter pendant 1 h dans une assiette préchauffée à 50 °C 2. Ajouter 6 mL d’eau distillée et agiter pendant 2 h 3. Ajouter 12 mL de Tris 200 mM (pH 8,5) et agiter pendant 10 min 4. Centrifuger à 5 000 × g pendant 15 min5. Aliquote et conserver à -20 °C.

Tableau 2 : Anticorps primaires. Les anticorps primaires, le clone et les dilutions optimisées utilisés pour l’immunomarquage sont répertoriés.

anticorps	Espèces hôtes	dilution
BARHL1	lapin	1/500
CALBINDIN	lapin	1/500
CARTE 2	souris	1/1000
N-CADHERINE	souris	1/1000
NESTIN	souris	1/400
OLIG2	lapin	1/500
PAX6	lapin	1/400
SOX2	souris	1/200
TBR1	lapin	1/200
TBR2	lapin	1/200
TUJ1	souris	1/1000

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Papier 3MM	WHA3030861	Merck
Anticorps anti-BARHL1	HPA004809	Anticorps Atlas
Anticorps anti-calbindine D-28k	Réf. CB28	Millipore
Anticorps anti-MAP2	Référence M4403	sigma
Anticorps anti-N-cadhérine	610921	Transduction BD
Anticorps anti-NESTIN	MAB1259-SP	R&D
Anticorps anti-OLIG2	MABN50	Millipore
Anticorps anti-PAX6	PRB-278P	Covance
Anticorps anti-SOX2	MAB2018	R&D
Anticorps anti-TBR1	AB2261	Millipore
Anticorps anti-TBR2	AB183991	Abcam
Anticorps anti-TUJ1	801213	Biolégende
Lamelles de recouvrement 24x60mm	Référence 631-1575	VWR
DAPI	10236276001	sigma
Sérum fœtal bovin	A3840001	ThermoFisher
Gélatine de peau de bovin	Référence G9391	sigma
Pot en verre	E94	ThermoFisher
glycine	MB014001	NZYtech
Monothioglycérol	Référence M6154	sigma
Mowiol	475904	Millipore	Support de montage
Triton X-100	Référence 9002-93-1	sigma
Préadolescent-20	Réf. P1379	sigma
Lames de microscope SuperFrost	12372098	ThermoFisher	Lames de microscope à adhérence