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1. Création d’organoïdes cérébraux à partir de la culture 2D iPSC / hESC (Jour 0)
Remarque : Ce protocole suppose que la maintenance des cellules souches (SC) est effectuée dans un milieu de maintenance de cellules souches exemptes de xénogrammes (SCMM) avec un substrat de vitronectine ou de Geltrex. Si vous utilisez un autre milieu de culture de cellules souches à haute teneur en protéines, il est conseillé de faire passer les cultures SC à la SCMM pendant au moins deux passages avant d’initier la formation d’organoïdes. Le protocole n’a pas été testé avec des méthodes de culture SC basées sur des mangeoires.
- En utilisant des méthodes d’entretien régulières des SC, amener les cultures à 50 % à 70 % de confluence. C’est généralement 3 à 4 jours après le passage, bien que cela puisse dépendre de la méthode de culture et de la lignée cellulaire.
note: Environ 2 puits d’une plaque de 6 puits sont nécessaires pour produire une plaque complète de 96 puits d’organoïdes.
- Inspectez les cultures par microscopie à fond clair à un grossissement de 10X-20X pour assurer une morphologie de colonie saine, sans différenciation détectable.
- Amener la SCMM à 37 °C dans un bain d’eau chaude et décongeler un flacon de 50 μL de 50 mM d’Y-27632 (inhibiteur de roche) et 2 mL de réactif de détachement enzymatique à température ambiante.
- Préparez une plaque à 96 puits à fond en U à très faible allongement (ULA), une pipette P200 multicanaux et un réservoir de réactif de 25 ml.
- Aliquote 45 mL de SCMM dans un tube conique de 50 mL et ajouter 45 μL de 50 mM Y-27632. Bien mélanger en triturant.
- Aspirez sous vide les deux puits contenant des SC et ajoutez rapidement 1 mL de réactif de détachement sans enzyme dans chaque puits à l’aide d’une pipette P1000. Incuber la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant 4 min.
- Aspirez sous vide les puits traités et ajoutez 1 mL de réactif de détachement enzymatique dans chaque puits à l’aide d’une pipette P1000.
- Incuber la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant 5 minutes supplémentaires.
- Retirez la plaque et examinez les puits traités. Tapotez doucement sur la plaque pour briser les cellules agrégées. Si de grands amas de cellules sont encore visibles, incubez la plaque pendant 2 minutes supplémentaires à 37 °C. Répétez cette étape jusqu’à ce que les amas ne soient plus visibles à l’œil nu.
- Une fois que les cellules sont correctement dissociées, ajoutez 1 mL de SCMM dans chaque puits pour désactiver les enzymes de dissociation. Placez les 4 mL de suspension cellulaire dans un tube conique de 50 mL et prélevez une petite aliquote pour le comptage des cellules.
- Retournez tous les puits non traités restants dans la plaque d’entretien dans l’incubateur à 37 °C.
- Pendant le comptage, centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min.
- Déterminez le nombre total de cellules et calculez la quantité de solution SCMM + Y-27632 qui sera nécessaire pour obtenir une suspension de 60 000 cellules/ml.
- Aspirez soigneusement le surnageant sous vide et ajoutez le volume calculé de solution SCMM + Y-27632. Mélanger 5 à 10 fois avec une pipette de 5 mL, en assurant une suspension cellulaire uniforme.
- Transférez immédiatement la suspension cellulaire dans un réservoir de réactif et pipetez 150 μL dans chaque puits de la plaque ULA à fond en U à 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux P200. Cela produit 96 organoïdes individuels, chacun composé initialement de 9 000 cellules.
- Centrifuger la plaque à 150 x g pendant 1 min.
- Placez la plaque dans un incubateur à 37 °C et ne dérangez pas la plaque pendant 48 h.
2. Maintenance des organoïdes cérébraux (Jour 2)
- Préparez 17 mL de SCMM avec 17 μL de 50 mM Y-27643 dans un tube conique de 50 mL. Réchauffez la solution SCMM + Y-27632 à 37 °C dans un bain d’eau chaude.
- Sortez la plaque organoïde de l’incubateur et, à l’aide d’une pipette multicanaux P200 réglée à 75 μL, aspirez lentement le milieu à partir du bord du puits sur la première rangée. Une fois que le milieu a été tiré, expulsez-le rapidement dans le puits pour soulever les cellules et les organoïdes libres. Répétez cette opération pour chaque ligne.
note: Cette technique, ci-après appelée « dispersion », soulève les débris cellulaires et l’organoïde en suspension. L’organoïde coule rapidement au fond du puits, tandis que les plus petits débris restent en suspension, ce qui permet de l’éliminer avec un changement de média. Cela permet d’empêcher l’organoïde de reposer dans les débris cellulaires pendant la culture.
- Une fois que tous les puits ont été dispersés, attendez 15 s pour vous assurer que les organoïdes ont coulé au fond de chaque puits.
- Aspirez lentement et soigneusement 75 μL de fluide de chaque puits à l’aide de la pipette multicanaux P200 et distribuez-le dans un réservoir à déchets.
note: La plupart des utilisateurs aspirent occasionnellement un organoïde lors d’une alimentation régulière. Cela peut se produire environ 1 % du temps. Veuillez planifier en conséquence pour vous assurer qu’un nombre suffisant d’organoïdes survivent jusqu’aux points expérimentaux.
- Transférez la solution SCMM + Y-27632 dans un réservoir de réactif et distribuez 150 μL dans chaque puits organoïde à l’aide de la pipette multicanaux P200.
- Remettez la plaque dans un incubateur à 37 °C.
3. Maintenance des organoïdes cérébraux (Jour 3)
- Réchauffer 17 mL de SCMM à 37 °C, cette fois sans Y-27643.
- Avec la pipette multicanaux P200 réglée à 100 μL, dispersez tous les puits de la plaque organoïde (voir étape 2.2). Attendez 15 s pour vous assurer que les organoïdes ont coulé au fond de leurs puits.
- Préparez un réservoir de déchets et transférez le SCMM chauffé dans un réservoir source.
- Aspirez soigneusement 125 μL de fluide de chaque puits et remplacez-le par 150 μL de SCMM frais à l’aide de la pipette multicanaux P200.
- Remettez la plaque dans un incubateur à 37 °C.
4. Maintenance des organoïdes cérébraux (Jour 4+)
Remarque : Effectuez cette maintenance régulière tous les deux jours jusqu’à l’infection.
- Avant de commencer le tétée du jour 4, préparez le milieu d’induction neuronale (NI).
- Décongeler une aliquote de 250 μL d’héparine à 2 mg/mL, ainsi qu’un flacon de 5 mL de supplément 100X N-2. Ajoutez 250 μL d'héparine, 5 mL de 100X N-2 et 5 mL de 100X Minimum Essential Medium-Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA) à 500 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) + GlutaMAX. Filtrer stérilement la solution mélangée dans un filtre de 500 mL.
Remarque : Maintenez NI à 4 °C lorsqu’il n’est pas utilisé ; NI dure jusqu’à deux semaines avant que le milieu frais ne soit préparé.
- Chauffer 17 mL de NI moyen à 37 °C.
- Avec la pipette multicanaux P200 réglée à 100 μL, dispersez tous les puits de la plaque organoïde (voir étape 2.2). Attendez 15 s pour vous assurer que les organoïdes ont coulé au fond de leurs puits.
- Préparez un réservoir de déchets et transférez le NI réchauffé dans un réservoir source.
- Aspirez soigneusement 125 μL de fluide de chaque puits et remplacez-le par 125 μL de NI frais à l’aide de la pipette multicanaux P200.
- Remettez la plaque dans un incubateur à 37 °C.
5. Infection organoïde par le virus Zika (ZIKV) (~Jour 24)
REMARQUE : Après environ 3 semaines de différenciation, il y aura de grandes structures neuroépithéliales et des rosettes visibles à l’intérieur de l’organoïde qui seront très sensibles à l’infection par le virus Zika.
- Apportez la solution saline équilibrée 1X (EBSS) d'Earle, la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1X et NI à 37 °C dans un bain d'eau chaude.
- Diluer le ZIKV de concentration connue dans 1X EBSS à la multiplicité de l’infection (MOI) cible.
note: Il est recommandé de titrer différents MOI pour obtenir une dose-réponse virale. Cela peut varier selon la souche du virus ; pour ATCC VR-1838 et ATCC VR-1843, les valeurs typiques du MOI varient entre 0,1 et 10).
- Retirez soigneusement tout le milieu du puits organoïde à l’aide d’une pipette P200 monocanal. Ajoutez rapidement 200 μL de 1X PBS dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanaux P200 pour laver les organoïdes.
- Retirez soigneusement tout le milieu du puits organoïde à l’aide d’une pipette P200 monocanal. Ajoutez rapidement 50 μL de solution de virus 1X EBSS uniquement (infection simulée) ou ZIKV pour bien et assurez-vous que l’organoïde est complètement immergé. Répétez l’opération pour chaque organoïde à infecter pour l’étude.
- Remettez la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant 2 h
note: L’incubation d’organoïdes faussement infectés pendant cette durée ne devrait pas avoir d’impact significatif sur leur croissance par rapport aux organoïdes non perturbés.
- Environ 30 minutes avant la fin de l’incubation virale, aliquote 25 mL de NI dans un tube conique de 50 mL et porter à 37 °C dans un bain d’eau chaude.
- Une fois l’exposition virale terminée, laver les organoïdes avec 200 μL de PBS 1X pour chaque puits, laisser les organoïdes reposer pendant 15 s, puis retirer 1X PBS à l’aide d’une pipette P200 monocanal.
- Ajoutez 200 μL de NI frais dans chaque puits et remettez-le dans l’incubateur.
- Facultatif : Pour un point temporel du jour 0, les organoïdes peuvent être imagés une heure après l’infection.
- Poursuivez la culture en remplaçant 125 μL de NI tous les deux jours en utilisant la méthode de dispersion (voir étape 4). Assurez-vous de bien éliminer les supports usagés et les embouts, car ils contiennent des particules infectieuses du virus Zika.