Évaluation de la viabilité neuronale dans une culture de neurones cérébelleux par double coloration

Résumé

Source : Jiajia, L., et al. Évaluation de la viabilité neuronale à l’aide de la double coloration à la fluorescéine diacétate-iodure de propidium dans une culture de neurones granulaires cérébelleux. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo montre la méthode d’identification des neurones à partir d’une culture mixte de neurones granulaires cérébelleux et de cellules gliales à l’aide d’une double coloration avec du diacétate de fluorescéine (FDA) et de l’iodure de propidium (PI), où les neurones vivants apparaissent en vert et les neurones morts en rouge.

Protocole

1. Double coloration FDA-PI et culture de granules cérébelleux (CGN)

1. Préparez une solution de travail de diacétate-iodure de propidium de fluorescéine (FDA-PI) en ajoutant 20 μL de solution mère FDA (concentration finale : 10 μg/mL) et 50 μL de solution mère d’IP (concentration finale : 50 μg/mL) dans 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Mélangez par vortex et placez-le sur de la glace.
   note: Préparez fraîchement la solution de travail FDA-PI juste avant de l’utiliser.
2. Sortez la plaque de culture cellulaire de l’incubateur. Mettez-le sur de la glace.
3. Aspirez le ....

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Sérum fœtal bovin	Gibco	10099141	un FBS de haute qualité est essentiel pour la culture
100× de glutamine	Gibco	25030081
100× antibiotique	Gibco	15240062
BME moyen	Gibco	21010046
Diacétate de fluorescéine	sigma	F7378
Iodure de propidium	sigma	Réf. P4170
Anticorps anti-GAP43 de lapin	Abcam	AB75810
Anticorps anti-GFAP de souris	Signalisation cellulaire	Référence 3670
Pipette Pasteur	Volac	Z310727	Brûlez la pointe ronde avant utilisation
Plaques de culture cellulaire à 6 puits	Le	Z707759	Une plaque de culture cellulaire de haute qualité est essentielle pour la culture
filtre	Millipore	SLGP033RB
Pipette 5 ml	Biographie Excell	Référence CS017-0003
Pipette 10 ml	Biographie Excell	Référence : CS017-0004
Incubateur à CO2	Thermo Scientific	311
Microscope à fluorescence	Nikon	TI-S
Filtre de fluorescence et cubes d’émission	Nikon	B-2A, G-2A, UV-2A
Logiciel photo	Nikon	Éléments NIS
Logiciel d’édition graphique	adobe	Photoshop CS
Logiciel de traitement d’images	Nih	ImageJ