1. Double coloration FDA-PI et culture de granules cérébelleux (CGN)
- Préparez une solution de travail de diacétate-iodure de propidium de fluorescéine (FDA-PI) en ajoutant 20 μL de solution mère FDA (concentration finale : 10 μg/mL) et 50 μL de solution mère d’IP (concentration finale : 50 μg/mL) dans 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Mélangez par vortex et placez-le sur de la glace.
note: Préparez fraîchement la solution de travail FDA-PI juste avant de l’utiliser.
- Sortez la plaque de culture cellulaire de l’incubateur. Mettez-le sur de la glace.
- Aspirez le milieu de culture et remplacez-le par du PBS.
froid
note: Le changement de solution doit se faire lentement et soigneusement. Évitez de toucher les cellules avec les pointes de pipette.
- Aspirez le PBS froid et remplacez-le par du FDA-PI froid (500 μL/puits pour les plaques de culture cellulaire à 12 puits ou 1 mL/puits pour les plaques de culture cellulaire à 6 puits). Laisser sur la glace pendant 5 min.
- Aspirez le FDA-PI et ajoutez du PBS froid (100 μL/puits pour les plaques de culture cellulaire à 12 puits ou 50 μL/puits pour les plaques de culture cellulaire à 6 puits).
note: Les cellules ne doivent pas sécher lors de la prise d’images.
- Prenez des images à l’aide de la microscopie fluorescente. Utilisez un filtre d’excitation avec une bande passante de 450 à 490 nm. Détecter les émissions de fluorescence pour FDA et PI à 520 et 620 nm, respectivement. Dans les mêmes conditions, prenez une image sous une lumière normale en utilisant le mode de contraste de phase de la microscopie fluorescente.
note: Prenez des images dans les 15 minutes suivant l’IP-FDA. Le temps d’exposition est de 100 à 300 ms et le gain analogique est de 2,8x.
2. Évaluation de la viabilité neuronale
- Pour la double coloration FDA-PI, superposez les images des cellules détectées après filtrage par différents filtres de fluorescence en faisant glisser la couche positive FDA sur la couche PI positive dans le logiciel d’édition graphique.
- Ajustez l’opacité du calque positif FDA en saisissant « 50 % » dans le champ « Opacité » du panneau « Calques ». Fusionnez deux calques en cliquant sur le bouton « Fusionner visible » dans le menu « Calque ». Réglez le contraste des images de superposition en entrant « 50 » dans le champ « Contraste » sous « Image"| « Ajustements » | Assurez-vous qu’il n’y a pas de cellules doublement positives FDA et PI dans les images superposées.
