1. Procédure de fixation et de coloration immunofluorescente
- À l’aide d’une pipette p200, transférez les cerveaux disséqués de la boîte à 9 puits dans un tube de microcentrifugation de 0,5 mL rempli de 0,5 mL de paraformaldéhyde à 4 % dilué dans du PTN (tampon de phosphate de sodium 0,1 M pH 7,2, tensioactif non ionique à 0,1 %). Au moins 10 à 15 cerveaux du même génotype peuvent être combinés dans un tube de microcentrifugation. Toutes les étapes restantes (jusqu’au montage des cerveaux sur les lames) sont effectuées dans des tubes de microcentrifugation de 0,5 ml.
prudence: Le paraformaldéhyde (PFA) doit être manipulé dans une hotte. Les déchets PFA doivent être conservés et éliminés correctement. Vingt pour cent du paraformaldéhyde acheté dans des ampoules en verre peut être aliquote dans des tubes de microcentrifugation et stocké à -20 °C jusqu’à ce qu’il soit nécessaire.
- À l’intérieur d’une hotte, incubez les cerveaux dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 20 minutes avec un balancement à vitesse lente à température ambiante.
- Après la fixation, laissez les cerveaux se déposer au fond du tube de la microcentrifugeuse par gravité.
note: Les cerveaux peuvent parfois se coller sur le côté du tube de microcentrifugation. Si cela se produit, il est généralement utile de faire pivoter latéralement le tube entre l’index et le pouce ou de tapoter doucement le tube sur le banc pour favoriser l’enfoncement du cerveau.
- Retirez le fixateur à l’aide d’une pipette p1000 et effectuez deux lavages « rapides » avec 500 μL de PTN, en laissant les cerveaux se déposer au fond du tube de microcentrifugation entre les lavages. Au cours de ces lavages rapides, une fois que tous les cerveaux se sont déposés par gravité au fond du tube de la microcentrifugation, le PTN peut être immédiatement remplacé par un nouveau tampon ; Aucun temps de lavage supplémentaire n’est requis.
note: En règle générale, il est préférable de laisser un tampon supplémentaire dans le tube plutôt que de risquer l’ablation du cerveau. Un examen minutieux de la pointe de la pipette est souvent nécessaire pour s’assurer qu’aucun cerveau n’a été retiré par erreur du tube. Si les cerveaux ont été accidentellement pipetés dans la pointe, réinjectez-les dans le tube de la microcentrifugeuse, attendez que les cerveaux se déposent, puis continuez à retirer tout PTN restant.
- Après le dernier lavage rapide, utilisez une pipette p1000 pour effectuer trois lavages « longs » : ajoutez 500 μL de PTN et lavez pendant 20 min à température ambiante sur un rocker/nutator. Tous les futurs lavages « longs » doivent durer 20 min.
note: Les cerveaux fixes peuvent être stockés toute la nuit à 4 °C dans le PTN après ces lavages.
- Retirer le dernier lavage à l’aide d’une pipette p1000 et incuber les cerveaux sur une bascule ou un nutator à température ambiante dans 0,5 mL de solution bloquante [PTN + 5 % de sérum de chèvre normal (NGS)] pendant au moins 30 min à température ambiante.
- Les anticorps secondaires de la chèvre seront utilisés dans les étapes ultérieures du protocole. Si des anticorps secondaires d’une autre espèce sont utilisés, le sérum normal de cette espèce (plutôt que le NGS) doit être utilisé dans les solutions de blocage et d’anticorps.
- À l’aide d’une pipette p1000, prélever la solution bloquante et ajouter l’anticorps primaire dilué dans le PTN (PTN + 5 % NGS + anticorps primaire dilué). Lors de la première utilisation d’un anticorps primaire, la dilution optimale de cet anticorps doit être déterminée empiriquement.
note: Pour visualiser les neurones du corps du champignon, des anticorps reconnaissant Fas2 sont généralement utilisés. Ces anticorps sont disponibles auprès de la Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) sous forme d’anticorps 1D4 et doivent être dilués 1:20 en PTN + 5 % NGS.
- Incuber les cerveaux dans une solution d’anticorps primaires sur un rocker/nutator pendant 2 à 3 nuits à 4 °C.
- Après l’incubation avec des anticorps primaires, laissez le cerveau se déposer au fond du tube de microcentrifugation, puis retirez la solution d’anticorps primaires.
- À l’aide d’une pipette p1000, effectuez 2 lavages « rapides » et 3 lavages « longs » de 20 minutes avec 0,5 mL de PTN comme décrit ci-dessus aux étapes 1.4 et 1.5, en laissant soigneusement les cerveaux se déposer par gravité au fond du tube de microcentrifugation entre chaque lavage.
- Incuber les cerveaux pendant 3 h à température ambiante avec des anticorps secondaires appropriés marqués par fluorescence. Les anticorps secondaires sont généralement dilués dans 0,5 mL de PTN + 5 % de NGS à une concentration de 1:200,
note: Une fois que des anticorps secondaires fluorescents ont été ajoutés, les cerveaux doivent être conservés dans l’obscurité pour le reste de l’expérience.
- Après l’incubation secondaire des anticorps, laissez les cerveaux se déposer au fond du tube de microcentrifugation et retirez la solution d’anticorps secondaire.
- Effectuez 2 lavages « rapides » et 3 lavages « longs » de 20 minutes avec 0,5 ml de PTN comme décrit ci-dessus aux étapes 1.4 et 1.5, en laissant soigneusement les cerveaux se déposer au fond du tube de microcentrifugation entre chaque lavage.
- Après le troisième lavage « long » de 20 minutes, utilisez une pipette p200 pour retirer autant de tampon que possible.
- Ajouter 75 μL de produit de montage fluorescent anti-décoloration dans le cerveau. Insérez une fois la cervelle et le milieu de montage dans la pointe de la pipette pour mélanger. N’inversez pas le tube car les cerveaux pourraient se coincer sur le capuchon ou les côtés du tube de microcentrifugation.
note: Après la suspension des cerveaux dans le milieu de montage, les tubes peuvent être enveloppés dans une feuille d’aluminium pour ralentir la trempe des fluorophores et stockés à 4 °C pendant la nuit. Si nécessaire, les cerveaux peuvent être stockés pendant plusieurs jours à 4 °C, mais l’idéal est de les monter sur des lames dès que possible.
2. Montage de cerveaux adultes de D. melanogaster sur des lames de microscope et imagerie
- Construisez un toboggan « pont ». Placez deux lamelles de « base » à environ 1 cm l’une de l’autre sur une glissière chargée positivement. Assurez-vous que le côté chargé positivement de la glissière est orienté vers le haut. Collez les lamelles sur la lame avec du vernis à ongles, comme illustré à la figure 1A. Il est généralement utile de sceller les trois bords extérieurs de chaque lamelle de base avec du vernis à ongles pour s’assurer que le support de montage ne s’embout pas sous ces lamelles de base. Laissez le vernis à ongles sécher complètement (10 à 15 min) avant de continuer.
- Placez la lame sous le stéréomicroscope et pipetez la solution de support de montage contenant les cerveaux disséqués dans l’espace entre les deux lamelles. Pour offrir plus de contraste, il est utile de manœuvrer les lumières à col de cygne de manière à ce qu’elles soient parallèles au dessus de la paillasse.
- Retirez le support de montage supplémentaire de la lame à l’aide d’une pipette, en prenant soin de ne pas pipeter le cerveau de la lame.
- Évacuez les supports de montage supplémentaires. Cela permettra de positionner plus précisément le cerveau lors de l’étape suivante.
- À l’aide d’une paire de pinces et du stéréomicroscope, positionnez les cerveaux sur la lame en grille avec les lobes antennaires vers le haut.
- Placez un lamelle (le « pont ») sur le cerveau (figure 1A). Utilisez du vernis à ongles pour sceller les côtés de la lamelle de pont là où ils entrent en contact avec les lamelles de « base ».
- À l’aide d’une pipette p200, remplissez lentement la cavité centrale sous le pont avec un nouveau support de montage (Figure 1B). Placez une goutte à la fois sur le bord ouvert de la lamelle centrale et laissez le support de montage s’évacuer sous la lamelle du pont central. Continuez jusqu’à ce que toute la cavité soit remplie de support de montage, puis scellez le haut et le bas avec du vernis à ongles transparent.
- Une fois que le vernis à ongles est sec, imagez immédiatement les lames ou rangez-les dans une boîte étanche à la lumière à -20 °C.
- En l’espace d’une semaine, imagez les cerveaux à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser avec des lasers d’excitation et des cubes de filtre appropriés aux anticorps secondaires fluorescents choisis. Les images Z-stack des neurones du corps du champignon sont généralement obtenues à l’aide d’objectifs 20X ou 40X.
