1. Préparation à la micro-injection
- Préparez l’injection en tirant les capillaires de verre à l’aide d’un extracteur de micropipette (voir le tableau des matériaux), en suivant le protocole en cinq étapes pour l’extraction de tubes capillaires en verre (tableau 1).
- Ouvrez l’extrémité de l’aiguille (capillaires en verre à paroi mince [3,5 po] avec filament, diamètre extérieur [OD] 1,14 mm) à la taille appropriée à l’aide d’une pince (figure 1A).
- Remplissez l’aiguille avec 0,1 mL d’huile minérale pour vous assurer qu’il n’y a pas de bulles.
- Retirez le capuchon à vis de l’aiguille en acier de l’appareil de micro-injection. Alignez le trou de l’aiguille en verre avec l’aiguille en acier, puis serrez le capuchon à vis. Montez l’appareil de micro-injection à aiguille chargé dans un micromanipulateur (voir tableau des matériaux).
- Ajustez la position de l’appareil de micro-injection de manière à ce que le micromanipulateur puisse déplacer l’appareil de manière flexible sous le microscope. Déchargez un certain volume d’huile de paraffine pour faire entrer l’aiguille d’acier dans le tube de verre capillaire.
- Déposez la solution injectable (telle que 1× solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou 5 mg/mL de LPS) sur une lame de verre stérilisée à l’éthanol à 70 % et ajustez l’appareil de micro-injection de manière à ce que l’embout soit inséré dans la goutte liquide. Chargez ~2 μL de solution injectable dans l’aiguille.
- Installez le micromanipulateur (réglage précis vers le haut, le bas, la gauche et la droite) de sorte que la pointe de l’aiguille de l’appareil de micro-injection se trouve dans le même champ de vision que les larves à fort grossissement (figure 1B).
2. Montage du poisson-zèbre pour les micro-injections
NOTE : Le développement du cerveau du poisson zèbre se produit dans les 3 jours suivant la fécondation (dpf) et mûrit à 5 dpf avec un système nerveux central bien développé. Par conséquent, les larves de 5 dpf conviennent déjà à l’étude des dommages neuronaux médiés par le LPS ainsi que des réponses comportementales et inflammatoires.
- Injectez les larves de poisson-zèbre dans les 30 minutes environ suivant l’atteinte du stade d’intérêt, afin de maintenir la cohérence du moment de l’injection.
- Pour anesthésier les larves de poisson-zèbre, combinez la tricaïne avec de l’eau propre de l’aquarium (concentration finale de 0,02 % p/v de tricaïne).
- Faites fondre une solution d’agarose à 2 % dans de l’eau doublement distillée (ddH2O) à l’aide d’un micro-ondes. Versez l’agarose fondu dans un plat en plastique. Le plat en plastique recouvert d’agarose à 2 % peut être conservé à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
- À l’aide d’une pipette de transfert en plastique, les larves anesthésiées se dirigent vers le centre de la boîte en plastique recouverte d’agarose à 2 %. Orientez les larves montées avec le côté cerveau vers le haut pour permettre l’accès à l’aiguille.
3. Injection du ventricule cérébral
- Ajustez le grossissement du microscope de manière à ce que la structure ventriculaire du cerveau du poisson-zèbre soit clairement affichée dans le champ de vision (Figure 1B).
- Placez l’aiguille avec précaution au-dessus du tectum cérébral (Figure 1C).
- Perforez lentement la peau du cerveau du poisson-zèbre avec la pointe de l’aiguille à l’aide du micromanipulateur.
- Appuyez sur la pédale pour éjecter 1 nL de 1x PBS ou différentes concentrations de LPS (1,0, 2,5 et 5,0 mg/mL) (voir le tableau des matériaux). À titre d’exemple, des images d’injection ventrale réussie dans lesquelles le ventricule cérébral a été injecté avec 1 nL de colorant bleu Evans à 1 % (dilué dans du PBS) sont présentées à titre d’exemple (Figure 1D). Transférez les larves dans un milieu d’eau d’œuf propre (E3) immédiatement après l’injection. Après 24 h, prélever les larves pour l’imagerie microscopique, l’analyse du comportement des locomotives et la détermination d’autres indicateurs.
