Modélisation de la mort neuronale induite par les espèces réactives de l’oxygène dans les neurones des granules cérébelleux de souris

1. Préparation expérimentale

REMARQUE : Les solutions mères suivantes peuvent être préparées et conservées jusqu’à utilisation.

1. Solution de dissection
   1. Dissoudre 3,62 g de chlorure de sodium (NaCl), 0,2 g de chlorure de potassium (KCl), 0,069 g de phosphate de sodium (NaH₂PO₄ ∙ H₂O) et 1,306 g de D-(+)-glucose dans 500 mL de H₂O distillé. Ensuite, ajoutez 12,5 ml de tampon HEPES, 450 μL de solution de rouge de phénol et 20 ml d’albumine sérique bovine (BSA) fraction V à la solution. Ajustez à pH 7,4 à l’aide de 1 N d’hydroxyde de sodium (NaOH).
   2. Stériliser avec un filtre de 0,22 μm et conserver à 4 °C. Cette solution restera stable jusqu’à une semaine à 10 jours.
2. trypsine
   1. Préparer une solution mère à une concentration de 25 g/L de trypsine dans du chlorure de sodium à 0,9 %. Conservez la solution à -20 °C.
3. Inhibiteur de la trypsine
   1. Préparez un bouillon à une concentration de 10 mg/mL en dissolvant 1 g d’inhibiteur de trypsine de blanc d’œuf de poule dans 100 mL de 1 mM de HCl. Conservez cette solution à -20 °C.
4. Désoxyribonucléase (DNase)
   1. Dissoudre 100 mg de DNase 1 dans 10 mL d’eau stérile pour générer un stock de 10 mg/mL. Conservez la solution à -20 °C.
5. MgSO₄
   1. Ajouter 6,02 g de sulfate de magnésium (MgSO₄) à 50 mL d’eau distillée (H₂O) pour obtenir un stock de 1 M. Conserver la solution à 4 °C.
6. CaCl₂
   1. Dissoudre 0,735 g de chlorure de calcium (CaCl₂∙ 2H₂O) dans 50 mL de H₂O distillé jusqu’à une concentration mère de 100 mM. Conserver la solution à 4 °C.
7. Kcl
   1. Dissoudre 3,7275 g de KCl dans 50 mL de H₂O distillé jusqu’à une concentration mère de 1 M. Conserver la solution à 4 °C.
8. D-(+)-glucose
   1. Dissoudre 1,802 g de D-(+)-glucose dans 50 mL de H₂O distillé jusqu’à une concentration mère de 100 mM. Conserver la solution à 4 °C.
9. Milieux de culture cellulaire
   1. Préparez le milieu de culture cellulaire comme suit : 5 ml de sérum de veau fœtal dialysé inactivé par la chaleur, 500 ml de 200 mM de L-glutamine, 100 ml de 50 mg/mL de gentamycine et 1 mL de 1,0 M de KCL doivent être ajoutés à 45 mL de milieu essentiel minimal d'Eagle stérilisé par filtre (E-MEM) qui est complété par 1,125 g/L de D-Glucose pour générer 50 mL de milieu de culture de neurones granulaires cérébelleux (CGN). Stockez le support à 4 °C.
10. Cytosine bêta-D-arabino furanoside
    1. Dissoudre 48 mg de cytosine bêta-D-arabino furanoside dans 10 mL de milieu de culture jusqu’à une concentration mère de 20 mM. Conserver la solution à -20 °C.
11. Poly-D-lysine
    1. Pour générer un stock de poly D-lysine de 2 mg/mL, ajoutez 10 mL de H₂O stérile à 20 mg de poly D-lysine. La poly D-lysine mère doit être stockée à -80 °C dans des aliquotes de 100 μL.
       note: Les solutions suivantes doivent être préparées avant la dissection et maintenues à 4 °C jusqu’à l’utilisation.
12. Solution de dissection supplémentée en MgSO₄
    1. Ajouter 300 μL de MgSO₄ à 250 mL de solution de dissection.
13. Solution de dissection de trypsine
    1. Ajouter 100 μL de trypsine mère et 12 μL de MgSO_mère 4 à 10 mL de solution de dissection.
14. Inhibiteur de la trypsine Solution 1
    1. Ajouter 164 μL d’inhibiteur de trypsine mère, 250 μL de DNase 1 mère et 12 μL de MgSO₄ mère à 10 mL de solution de dissection.
15. Inhibiteur de la trypsine Solution 2
    1. Ajouter 1040 μL d’inhibiteur de trypsine mère, 750 μL de DNase mère 1 et 12 μL de MgSO₄ mère à 10 mL de solution de dissection.
16. Solution de dissection supplémentée en CaCl₂
    1. Ajouter 10 μL de CaCl₂ et 25 10 ml de MgSO₄ à 10 mL de solution de dissection.
17. Boîtes de culture enrobées de poly D-lysine
    1. Pour enrober les boîtes de culture, diluer 100 μL de poly D-lysine mère dans 40 mL de H₂O stérile. Pour les boîtes de culture de Nunc de 35 mm, ajouter 2 mL de solution de poly D-Lysine diluée. Pour les plaques à 4 puits, ajoutez 300 μL de poly D-Lysine diluée dans chaque puits.
    2. Laissez reposer la poly D-lysine pendant 1 h avant d’aspirer et de laver chaque puits avec 4 mL ou 600 μL (pour des boîtes de culture de 35 mm ou des plaques à 4 puits, respectivement) de H₂O stérile. Aspirez ensuite le H₂O et laissez sécher la vaisselle à l’air libre pendant 1 h.

2. Extraction cérébrale et isolement du cervelet

1. Décapitez un bébé souris de 6 à 7 jours à l’aide de ciseaux de décapitation. Effectuez la dissection du cerveau dans une hotte de culture de tissus stériles.
2. Pour retirer le cerveau, saisissez la tête à l’aide d’une paire de pinces et coupez la peau vers l’avant de la tête à l’aide de ciseaux de microdissection, comme le montre la figure 1. Ensuite, coupez l’os du crâne à l’aide d’une nouvelle paire de ciseaux pour minimiser le risque de contamination. Retirez le crâne recouvrant le cerveau à l’aide d’une pince et démêlez le cerveau à l’aide d’une pince ou d’une spatule.
   1. Au besoin, coupez le nerf optique pour faciliter l’évacuation du cerveau dans son ensemble.
3. Placez le cerveau dans la solution de dissection, qui est complétée par du MgSO₄. Gardez la solution et le cerveau sur la glace.
4. Après l’ablation du cerveau, sous un microscope de dissection, disséquez le cervelet du cerveau alors qu’il est encore dans une solution de dissection supplémentée en MgSO₄, et retirez les méninges à l’aide d’une pince fine. Tournez le cervelet vers sa face ventrale et assurez l’ablation du plexus choroïde.
5. Placez le cervelet dans une boîte de 35 mm contenant ~1 mL de solution de dissection supplémentée en MgSO₄.
6. Coupez le tissu en petits morceaux et transférez-le dans un tube de 50 ml contenant 30 ml de solution de dissection tamponnée de MgSO₄.

3. Isolement et culture des neurones à granules cérébelleux de souris

1. Centrifugez le tube de 50 mL contenant le tissu cérébral haché pendant 5 min à 644 x g et 4 °C.
2. Retirer le surnageant et ajouter 10 mL de solution de dissection de trypsine. Ensuite, agitez le tube à grande vitesse pendant 15 min à 37 °C.
3. Ajouter 10 ml de la solution 1 d’inhibiteur de la trypsine dans le tube et secouer doucement pendant 2 minutes.
4. Centrifuger le tube pendant 5 min à 644 x g et 4 °C.
5. Retirer le surnageant et ajouter 2 mL de solution 2 d’inhibiteur de trypsine, puis transférer dans un tube de 15 mL.
6. Triturez le tissu dans le tube de 15 mL jusqu’à ce que la solution devienne trouble. Laissez ensuite reposer 5 min.
7. Retirer le surnageant clair et le transférer dans un nouveau tube contenant 1 mL de solution de dissection supplémentée en CaCl₂.
8. Ajouter un autre mL de la solution 2 de l’inhibiteur de la trypsine au fond du tube contenant la pastille de l’étape 3.6. Triturer à nouveau et laisser reposer 5 min. Retirez le surnageant et ajoutez-le dans le tube contenant le surnageant de l’étape 3.7 (c’est-à-dire une répétition des étapes 3.6-3.7). Répétez ce processus jusqu’à ce que la majeure partie du tissu soit dissociée mécaniquement.
9. Ajouter 0,3 mL de solution de dissection supplémentée en CaCl₂ à la collection de surnageant pour chaque mL de surnageant.
10. Mélangez le contenu du tube puis centrifugez pendant 5 min à 644 x g.
11. Retirer le surnageant et ajouter 10 ml de milieu frais à la pastille et mélanger.
12. Les cellules peuvent ensuite être comptées et diluées à une concentration de 1,5 x 10⁶ cellules/mL. Veuillez noter qu’en général, 10 millions de cellules sont attendues de chaque cerveau disséqué, en fonction du temps de trypsinisation et de l’efficacité de la dissection. Cellules sur plaques de plaques de poly D-lysine préalablement fabriquées. Pour les plaques à 4 puits, la plaque est de 0,5 mL, ce qui donne^7,5 x 10 5 cellules par puits. Pour les plats de 35 mm, plaque 4 mL, ce qui donne 6 x 10⁶ cellules par plaque.
13. Après 24 h, ajoutez la cytosine-β-arabino furanoside (AraC) dans les plaques pour réduire la contamination gliale. Pour chaque mL de support, 0,5 μL de 20 mM d’AraC est nécessaire. L’ajout d’AraC ne nécessite pas de changement de support. Si les cellules doivent être maintenues pendant 7 à 8 jours, répétez ce traitement le 3e jour.
14. Maintenir les cultures dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C et les nourrir avec 100 μL de glucose 100 mM ajoutés à la culture pour chaque 2 mL de milieu tous les 2 jours au-delà des 5 derniers jours. Il n’est pas nécessaire de changer complètement de support.

4. Modélisation des lésions neuronales

1. Pour induire la mort cellulaire induite par les ROS (stress oxydatif), traitez les neurones avec du peroxyde d’hydrogène de 75-100 μM (H₂O₂) et passez à des milieux conditionnés à partir de cultures parallèles après une exposition de 5 minutes à H₂O₂. Notez qu’en raison de l’instabilité de H₂O₂, optimisez la concentration à un niveau qui induit 50 à 70 % de mort cellulaire en culture après 24 h de traitement (Figure 2).

Figure 1 : Ablation du cerveau d’une souris et dissection du cervelet. (A) Pour extraire le cerveau d’une souris âgée de 6 à 7 jours, à l’aide d’une paire de pinces, saisissez la tête et coupez la peau vers l’avant le long des lignes pointillées à l’aide d’une paire de ciseaux de microdissection. Attention à ne couper que la peau et le tissu conjonctif, une incision trop profonde risque de perforer le crâne et d’endommager le cerveau. Ces trois incisions, droites le long de la ligne médiane, et deux incurvées latéralement, permettent de repousser la peau vers l’arrière et de révéler le crâne. Une fois exposé, le crâne peut être pénétré avec la pointe des ciseaux, et coupé vers l’avant. Il faut faire très attention à ne pas endommager le cervelet pour faciliter l’identification et l’ablation des méninges. Une fois coupé, les pinces peuvent être utilisées pour décoller le crâne, exposant le cerveau qui peut ensuite être extrait dans une solution de dissection froide à l’aide d’une paire de pinces ou d’une spatule. Afin d’enlever le cerveau, le nerf optique peut avoir besoin d’être sectionné. (B) Une fois retirées du crâne, les méninges doivent être retirées du cervelet à l’aide d’une paire de pinces à pointe fine. (C) À l’aide d’une paire de pinces à pointe fine, le cervelet est disséqué du tissu restant et inspecté pour assurer l’élimination complète des méninges.

Figure 2 : Modélisation des lésions neuronales dans les neurones granulaires cérébelleux. Les souris cérébelleuses isolées des jours 6-7 sont dissociées en cellules uniques selon la procédure présentée dans la partie 3. Après dissociation, les cellules sont comptées et remises en suspension dans un volume de milieu de culture pour générer 1,5 x 106 cellules/mL.Pour les boîtes de 35 mm, 4 mL sont plaqués, ce qui donne 6 x 106 cellules par plaque. Pour les lames d’imagerie, 0,5 mL est plaqué, ce qui donne7,5 x 10 5 cellules/puits. Les CGN peuvent alors être transduits par le lentivirus ou infectés par l’adénovirus. L’utilisation de l’adénovirus le jour de l’enrobage (0 jour in vitro (DIV)) donne une efficacité de transfection supérieure à 90 % et permet d’étudier les lésions neuronales dues au stress oxydatif et aux dommages à l’ADN. L’ajout de 10 μM de camptothécine (CPT) induira des dommages à l’ADN, tandis que 75-100 μM de peroxyde d’hydrogène (H2O2) induira un stress oxydatif. La concentration deH2O2 doit être optimisée pour induire 50 % de mort cellulaire après 24h. L’infection par des adénovirus à 5 DIV donne une efficacité de transduction inférieure à 10 %. À 7 DIV, lorsque les récepteurs NMDA sont enrichis dans la culture, les neurones peuvent être traités avec 100 μM de NMDA et 10 μM de glycine pour induire une excitotoxicité. C’est idéal pour l’analyse d’imagerie ultérieure ou le traçage d’un seul neurone. Enfin, la transduction avec le lentivirus à 0 DIV, suivie d’un traitement avec 100 μM NMDA et 10 μM de glycine à 7 DIV, donne une efficacité de transduction suffisamment élevée (>80 %) pour permettre l’analyse biochimique de la culture, y compris le séquençage ChIP, l’examen de l’expression des protéines et la réalisation de tests vivants/morts.