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Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Immunohistochimie
- Coloration analogique de la thymidine
- Placez des coupes de tissus dans du PBS (solution saline tamponnée au phosphate) et montez 5 à 8 sections sur une lame chargée positivement, en maintenant l’ordre en série de l’avant vers l’arrière et la même orientation. Laissez sécher les sections de tissu pour qu’elles adhèrent complètement aux diapositives, puis tracez une bordure à l’aide d’un stylo hydrophobe ou d’un stylo PAP.
- Perméabiliser les sections avec un tampon de perméabilisation (0,5 % de solution saline tamponnée tris -triton) pendant 20 à 30 min. Ensuite, lavez les sections 2 fois avec du TBS-triton pendant 5 min chacune.
REMARQUE : La perméabilisation facilite la pénétration des anticorps intracellulaires. Le temps de perméabilisation peut être ajusté en fonction de l’épaisseur des tissus et de l’efficacité des anticorps. Alternativement, on peut augmenter la concentration du détergent pour augmenter le pouvoir de perméabilisation. Cependant, il faut veiller à ne pas perméabiliser trop longtemps car la fragilité des tissus augmente avec le temps de perméabilisation prolongé.
- Préparez la solution réactionnelle d'Edu (5-éthynyl-2'-désoxyuridine) conformément au tableau 1. La concentration finale d’azoture Alexa488 est de 15 μM dans 1 mL de solution réactionnelle d’Edu.
- Incuber des sections dans la solution réactionnelle Edu pendant 30 min à 1 h, puis laver 3 fois dans du triton TBS pendant 5 min chacune. Après cette étape, couvrez les lames dans du papier d’aluminium pour les protéger de la lumière. À ce stade, vérifiez si la réaction Edu fonctionne à l’aide d’un microscope fluorescent. Les cellules marquées Edu-Eden seront fluorescentes sous un microscope à épifluorescence.
- Protocole de section de tissu monté
- Bloquez des sections de tissu montées sur une lame à partir de l’étape 1.1.4 à l’aide d’un tampon de blocage élevé chez les mêmes animaux que l’anticorps secondaire, par exemple du sérum d’âne, pendant 30 min à 1 h, puis lavez-vous 2 fois dans du triton TBS pendant 5 min chacun.
- Préparez une solution d’anticorps primaires (c.-à-d. de l’anti-nestine de poulet) pendant l’étape de blocage en mélangeant les anticorps primaires dans une solution tampon bloquante à 1:200. 250 μL par lame sont suffisants pour s’assurer que le tissu est complètement immergé dans la solution.
- Incuber des sections de tissu dans une solution d’anticorps primaires pendant la nuit à l’heure de l’artérologie après avoir bloqué les lavages. Modifiez cette étape en fonction de l’anticorps primaire utilisé.
note: Si les anticorps ont un bruit de fond élevé ou une liaison non spécifique, l’incubation à 4 °C au lieu de RT (température ambiante) peut améliorer les résultats. Les anticorps à faible pénétration tissulaire peuvent être laissés à incuber pendant 2 jours si nécessaire.
- Incuber 3 fois des coupes de tissu dans du TBS-triton pendant 5 minutes pour éliminer l’excès d’anticorps primaire. Ensuite, incuber des coupes de tissus dans des anticorps secondaires conjugués aux fluorophores (p. ex., anti-poulet Alexa 647 à 1:200) préparés dans une solution tampon bloquante pendant 2 h à RT.
- Incuber des coupes de tissu 3 fois dans du TBS-triton pendant 5 minutes pour éliminer l’excès d’anticorps secondaires et appliquer une solution de DAPI (4′,6-diamidino-2-phénylindole) de 300 μM à 1:100 dans du PBS pendant 15 min à RT.
- Incuber 3 fois des sections de tissu dans du PBS pendant 5 minutes pour éliminer l’excès de DAPI et retirer le cercle du stylo Pap autour du tissu à l’aide d’un coton-tige ou d’une lingette délicate. Laissez sécher les sections, puis appliquez le support de montage et la lamelle. Laissez sécher le support de montage avant d’imager les diapositives.
Tableau 1 : Solutions utilisées pour l’immunohistochimie
| Solution antigel | Éthylène-glycol 150 mL + saccharose 150 g + remplissage à 500 mL 0,1 M PB pour solution de 500 mL |
| Tampon de citrate | 9 mL de stock d’acide citrique + 41 mL de tampon de citrate tri-sodique + 450 mL de ddH2O |
| Stock d’acide citrique | [0,1 M] Acide citrique 21 g/1 L ddH2O |
| Stock de citrate tri-sodique | [0,1 M] Citrate trisodique 29,4 g/1 L ddH2O |
| Tris Saline tamponnée -Triton (TBS -Triton) | 0,05 % 100 fois Triton en TBS |
| Tampon de perméabilisation | 0,5 % 100-x Triton en TBS |
| Tampon de blocage | 0,33 mL de sérum d’âne dans 10 mL de TBS-Triton |
| Solution de réaction Edu | Préparez une solution de CuSO4·5H2O en ajoutant 1 mg de CuSO4·5H2O dans une solution de 4 mL de [0,1 M] Tris pH 8,5. Ajoutez ensuite 1:40 d’une solution d’azoture d’Alexa488 de 600 μM et 10 mg/mL d’ascorbate de L-Na+ à la solution CuSO4·5H2O avant de l’appliquer sur les tissus. |