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1. Maintenance de la culture de cellules microgliales
- Milieu de culture cellulaire chaud (milieu Eagle modifié de Dulbecco ; DMEM) complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine/néomycine (PSN) à 37 °C.
- Obtenir un stock congelé de cellules microgliales BV2 au passage 18 - 25 à partir d’un stockage à -80 °C. Décongeler rapidement les cellules dans un bain d’eau à 37 °C.
- Transférez délicatement les cellules dans une fiole ventilée de 75 cm2 contenant 10 ml de milieu de culture cellulaire.
- Incuber le ballon dans 5 % de CO2 à 37 °C. Aspirer le milieu après 24 heures et le remplacer par un milieu frais. Développer les cellules jusqu’à environ 70 à 80 % de confluence.
2. Comptage et placage des cellules
- Dans un bain-marie à 37 °C, réchauffer une solution de DMEM et d’acide 1x-trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA).
- Aspirez le milieu des cellules et ajoutez 500 μl de trypsine. Incuber à 37°C pendant 2 à 5 min.
- À l’aide d’un grattoir, retirer les cellules de la fiole et les suspendre dans 5 ml de DMEM. Passez trois fois les cellules à travers une passoire de 70 μm dans un tube de 50 ml.
- Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ensemencez 8 000 cellules/puits dans une plaque inférieure transparente à paroi noire dans un volume final de 200 μl de DMEM complété par 10 % de FBS et 1 % de PSN. Incuber la plaque dans 5 % de CO2 à 37 °C pendant 24 h.
- Retirez l’ancien DMEM et remplacez-le par 200 μl de DMEM réchauffé complété par 1 % de PSN pour affamer la microglie sérique. Incuber la plaque dans 5 % de CO2 à 37 °C pendant 24 h.
3. Activation de la microglie
- Dans des tubes séparés, diluer des nanoparticules d’argent (AgNPs) (0,01, 0,05 ou 0,1 μg/ml) et un témoin véhicule/neutre (citrate de sodium, 0,04 mM) dans du DMEM sans sérum complété par 1 % de PSN jusqu’aux concentrations de travail finales.
- Retirer 100 μl de média de chaque puits et le remplacer par 100 μl de composé de traitement approprié.
- Incuber la plaque dans 5 % de CO2 à 37 °C pendant 24 heures.
4. Filtrage des milieux conditionnés
- Prélever 200 μl de surnageant de média dans chaque puits et les transférer dans un filtre (seuil de coupure du poids moléculaire de 10 kDa) avec tube de prélèvement (capacité de 1,5 à 2 ml).
- Centrifugeuse à 14 000 x g à température ambiante pendant 15 min.
- Jetez le filtre à flux continu (surnageant avec des particules) et placez le filtre à l’envers dans un nouveau tube de collecte.
- Centrifugeuse à 1 000 x g à température ambiante pendant 2 min
note: Le média filtré résultant (contenant des cytokines sécrétées) est concentré par six.
- Porter le volume du concentré à 400 μl avec du DMEM frais complété par 10 % de FBS et 1 % de PSN et stocker sur de la glace.
5. Maintenance de la culture cellulaire hypothalamique
- Milieu de culture cellulaire DMEM chaud complété par 10 % de FBS et 1 % de PSN à 37 °C.
- Obtenir un stock congelé de cellules hypothalamiques (mHypo-A1/2) au passage 18 - 25 stockées à 80 °C. Décongeler rapidement les cellules dans un bain d’eau à 37 °C.
- Transférez délicatement les cellules dans une fiole ventilée de 75 cm2 contenant 10 ml de milieu de culture cellulaire.
- Incuber le ballon dans 5 % de CO2 à 37 °C. Aspirer le milieu après 24 heures et le remplacer par un milieu frais. Cultivez les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent environ 70 à 80 % de confluence.
6. Détermination de la toxicité des cellules hypothalamiques
- Solution chaude de DMEM et de 1x-trypsine-EDTA dans un bain-marie à 37 °C.
- Aspirez du milieu à partir de cellules hypothalamiques et ajoutez 500 μl de trypsine. Incuber à 37 °C pendant 2 à 5 min. Retirez les cellules du ballon à l’aide d’un grattoir, comme décrit ci-dessus à l’étape 2.
- Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et de cellules hypothalamiques en plaque à 5 000 cellules/puits dans une plaque à fond transparent à paroi noire dans un volume final de 200 μl de DMEM complété par 10 % de FBS et 1 % de PSN, et incuber pendant la nuit dans 5 % de CO2 à 37 °C.
- Retirez 100 μl de l’ancien média à l’aide d’une pipette multicanaux et ajoutez 100 μl de média filtré concentré conditionné à une concentration finale de 1x.
- Incuber la plaque dans 5 % de CO2 à 37 °C pendant 24 h.
- Ajouter 22 μl de réactif de résazurine et incuber la plaque pendant 20 min dans 5 % de CO2 à 37 °C.
- À l’aide d’un spectrophotomètre multimode, enregistrez la fluorescence (560 nm EX/590 nm EM) pour mesurer la viabilité cellulaire. Indiquez les résultats sous forme d’unités de fluorescence relative (RFU).