1. Préparation des réactifs et de l’équipement
- Préparez 1 tampon de dissection (70 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 0,02 mM de CaCl2, 20 mM de MgCl2, 10 mM de NaHCO3, 115 mM de saccharose, 5 mM de tréhalose, 5 mM d’acide hydroxyéthylpipérazine éthane sulfonique [HEPES] ; pH 7,2).
- Préparez 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Préparez 1x PBT en utilisant 1x PBS avec 0,01 % Triton X-100.
- Préparez des plaques de gélose au jus de fruits.14 Brièvement, mélangez 30 g de gélose dans 700 mL de H2O et d’autoclave. Dissoudre 0,5 g de méthylparabène dans 10 mL d’éthanol et ajouter la solution à 300 mL de concentré de jus de fruit (raisin ou pomme). Mélanger le concentré dans une solution de gélose autoclavée et verser dans les couvercles des boîtes de Pétri de 10 mm x 35 mm.
note: Le prémélange puissant de gélose à raisin peut également être acheté auprès de diverses entreprises (voir le tableau des matériaux).
- Procurez-vous des pinces de taille 5 qui permettent de blesser mécaniquement les larves.
- Utilisez un appareil d’anesthésie standard à base de CO2 pour la drosophile.
2. Sélection des larves de drosophile
- Prélever une fiole ou une bouteille de drosophile contenant des larves errantes du troisième stade qui ont été cultivées à 25 °C.
- Sélectionnez dix larves individuelles du 2e ou du 3e stade en fonction de leur apparence. Les larves du troisième stade peuvent être identifiées par l’apparition de spiracles ramifiés antérieurs, tandis que les larves du deuxième stade sont plus petites et ont des spiracles antérieurs plus en forme de massue.
note: Les stades larvaires peuvent également être identifiés par le timing. À 25 °C, les larves du deuxième stade apparaissent environ 48 h après l’éclosion, et les larves du troisième stade muent environ 24 h plus tard. Si l’on souhaite examiner la neurodégénérescence au NMJ, les larves du deuxième stade doivent être blessées.
3. Préparation des larves de drosophile aux lésions mécaniques
- Ramassez soigneusement les larves individuelles à l’aide d’une pince ou d’un pinceau, en faisant attention de ne pas les comprimer de quelque manière que ce soit.
- Placez directement dix larves dans un plat en verre contenant du PBS 1X froid ou un tampon de dissection pour éliminer tous les débris alimentaires et ralentir la motilité larvaire.
4. Lésions mécaniques et traitement des larves de drosophile
- Placez chaque larve sur un appareil anesthésiant au CO2.
- À l’aide d’un microscope à dissection, roulez soigneusement chaque larve sur sa face dorsale afin de visualiser les nerfs segmentaires à travers la cuticule.
- Positionnez la pince de taille 5 à environ 1/2 à 2/3 sur la longueur de la larve en commençant par les crochets buccaux. Une fois positionné, pincez environ 1/3 de la cuticule ventrale contenant les nerfs segmentaires avec une pince de taille 5.
- Pour vous assurer que les nerfs segmentaires larvaires sont blessés, appliquez une force suffisante pour écraser les nerfs segmentaires, mais laissez la cuticule intacte. Pour déterminer la bonne quantité de force, écrasez 10 larves et assurez-vous que le taux de mortalité après 5 h est inférieur à 50 %.
- Après les blessures, transférez soigneusement les larves dans une plaque de gélose au jus de fruit contenant environ 0,5 g de pâte de levure. Placez chaque larve de manière à ce que son extrémité antérieure soit sur la pâte de levure, pour une alimentation continue malgré une motilité perturbée.
note: Pour s’assurer que les nerfs segmentaires larvaires ont été lésés, une motilité larvaire perturbée peut être observée après le transfert sur la plaque de gélose. Les larves blessées sont effectivement paralysées à l’arrière du site de la blessure, mais peuvent toujours bouger leurs crochets buccaux et se nourrir. Un taux élevé de mortalité des animaux après une blessure est courant, il est donc préférable de blesser 20 à 50 % plus d’animaux que nécessaire pour une expérience.
- Placez des plaques de gélose contenant de la pâte de levure et 10 larves blessées au fond d’une boîte de Pétri vide de 100 x 15 mm. Couvrez cette plaque de Pétri, contenant maintenant les larves blessées sur une plaque de gélose, avec une serviette en papier humide, en veillant à ce que la serviette en papier ne touche pas les larves ou les plaques de gélose. Placez cette boîte de Pétri dans un récipient hermétique plus grand, à température ambiante (RT).
- Récupérer les larves pour les disséquer après des périodes spécifiées (6, 12 ou 24 h) après la blessure.
note: Pour examiner les effets immédiats d’une lésion sur le cytosquelette axonal, les larves peuvent être disséquées directement après la lésion. Pour examiner les défauts de transport axonal, les larves peuvent être disséquées environ 6 h après la blessure. Environ 12 h après la blessure, une accumulation de protéines ubiquitinées peut être observée, et 24 h après la blessure, une dégénérescence des motoneurones au niveau de la JNM peut être observée.