Détermination de la rupture de la barrière hémato-encéphalique à l’aide de colorants fluorescents dans un modèle murin EAE

Résumé

Source : Tietz, S. M., et al., Visualisation de l’altération des barrières endothéliales et gliales de l’unité neurovasculaire au cours de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale in vivo. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo présente une procédure d’évaluation de la rupture de la barrière hémato-encéphalique dans un modèle murin EAE. Des colorants fluorescents de différentes tailles sont injectés rétro-orbitaire et circulent dans les vaisseaux sanguins du cerveau. Le plus petit colorant s’échappe par des interstices dans le tissu cérébral, tandis que le plus grand colorant n’y pénètre que si la perturbation est grave, en corrélation avec l’étendue des dommages à la barrière.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Essai de perméabilité in vivo

1. Préparation des solutions :
   1. Pour les solutions mères de dextran, dissoudre 10 mg de 10 kDa de Dextran Alexa Fluor 488 ainsi que 3 kDa de Dextran Texas Red dans 500 μL de solution de chlorure de sodium à 0,9 % (20 mg/mL).
   2. Pour la solution de travail du dextran, juste avant l’injection, pipeter 55 μL de la solution mère de Dextran Alexa Fluor 488 de 10 kDa (20 mg/mL) sur un morceau de film d’étanchéité et ajouter 55 μL de solution mère de dextran Texas Red de 3 kDa (20 mg/mL). Mélanger et prélever 100 μL dans une seringue fine jetable (concentration finale 2 mg/100 μL).
   3. Pour la solution mère de formaldéhyde à 10 % (paraformaldéhyde, ou PFA), mélangez 10 g de poudre extra pure PFA, 100 ml de PBS et 200 μL d’hydroxyde de sodium 1N (NaOH) dans un bécher en verre propre et chauffez à 56 °C précisément en agitation à l’aide d’un agitateur magnétique. Maintenir à 56 °C pendant 30 min jusqu’à ce que le PFA soit complètement dissous. Refroidir à température ambiante, ajuster le pH à 7,4 et filtrer à travers un filtre en papier. Conserver à 20 °C. La solution mère peut être diluée à l’aide d’une solution saline tamponnée au phosphate ou de PBS.
2. Anesthésier brièvement des souris C57BL/6 saines ou des souris C57BL/6 souffrant d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, ou d’EAE avec de l’isoflurane (la souris sera sous sédatif pendant environ 1 min). Utilisez un système automatisé (les souris seront exposées à 4,5 % d’isoflurane dans de l’oxygène dans une chambre d’induction, puis transférées dans un masque facial contenant 2,1 % d’isoflurane).
3. Placez la souris anesthésiée en position latérale sur la table, puis injectez par voie intraveineuse (par exemple rétro-orbitaire) 100 μL de traceurs fluorescents dans la souris avant que celle-ci ne se réveille.
4. Retirez immédiatement le masque facial et assurez-vous que la souris est complètement éveillée et mobile après la courte anesthésie. Laissez circuler le traceur pendant 15 minutes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Dextran Alexa Fluor 488 (10 000 MW)	par exemple sondes moléculaires	Réf. D22910	Conserver à -20 °C, à l’abri de la lumière
Dextran Texas Red (3000 MW)	Invitrogen	D3328	Conserver à -20 °C, à l’abri de la lumière
Alimentation d’entretien	par exemple PROVIMI KLIBA SA	Référence 3436
paraformaldéhyde	Merck	Référence 30525-89-4
NaCl 0,9 %	B. Braun	3535789
Film d’étanchéité, par exemple Parafilm M	par exemple Sigma-Aldrich	Réf. P7793
Seringue 1 ml	par exemple PRIMO	Référence 62.1002