Immunocoloration des tissus craniofaciaux de souris

Résumé

Source : Yang, J., et al., Préparation tissulaire et immunocoloration des tissus craniofaciaux de souris et de l’os non décalcifié. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo démontre la coloration par immunofluorescence de cryosections de tissus craniofaciaux embryonnaires de souris, en utilisant la microscopie à fluorescence pour évaluer l’expression des marqueurs nucléaires et déterminer la prolifération cellulaire et l’activité de signalisation.

Protocole

Texte de l’avertissement : Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Coloration par immunofluorescence

1. Sortez les diapositives à partir de -80 °C. Conservez les diapositives à RT pendant 1 h pour sécher les sections à l’air. Rincer les lames avec du PBST à 0,1 % (0,1 % de polyéthylène glycol tert-octylphényléther dans du PBS ; voir le tableau des matériaux) trois fois pendant 5 minutes chacune pour laver l’OCT et perméabiliser les sections.
2. En option, effectuez une récupération d’antigène (facultatif).
   1. Préchauffez le tampon de citrate (10 mM de citrate de sodium pH 6) dans le plat de coloration à l’aide d’un vaporisateur vapeur ou d’un bain-marie à 95-100 °C. Immergez les lames dans le tampon de citrate et incubez pendant 10 min.
   2. Sortez le plat de coloration du cuiseur vapeur ou du bain-marie et refroidissez les lames à température ambiante pendant 20 minutes ou plus15.
      note: Comme alternatives, utilisez le tampon Tris-EDTA (10 mM de base Tris, 1 mM d’EDTA, 0,05 % Tween 20, pH 9,0) ou le tampon EDTA (1 mM d’EDTA, 0,05 % de Tween 20, pH 8,0) pour la récupération d’antigènes induite par la chaleur. Utilisez un autocuiseur, un micro-ondes ou un bain-marie pour la récupération d’antigènes induite par la chaleur en plus du cuiseur vapeur chaud. Une récupération d’antigène induite par une enzyme à l’aide de trypsine ou de pepsine est une autre alternative. Optimiser la concentration et le temps de traitement de la récupération enzymatique pour éviter d’endommager les sections. Optimisez la méthode de récupération de l’antigène pour chaque combinaison anticorps/antigène.
3. Incuber chaque lame avec 200 μL de solution bloquante (sérum d’âne à 5 % dilué dans 0,1 % de PBST) à RT pendant 30 min, puis retirer la solution bloquante sans rincer.
4. Incuber chaque lame avec 100 μL d’anticorps primaires ou d’anticorps dilués dans une solution bloquante pendant 1 h à RT ou O/N à 4 °C. Rincer les lames avec du PBS trois fois pendant 10 min chacune à RT.
5. Incuber chaque lame avec 100 μL d’anticorps secondaires dilués dans une solution bloquante pendant 1 h à RT. Rincer les lames au PBS trois fois pendant 10 min chacune à RT. Protéger les lames de la lumière.
6. Montez des glissières.
   1. Ajouter deux gouttes de milieu anti-décoloration avec du DAPI (4', 6-diamidino-2-phénylindole) sur la lame. Recouvrez ensuite avec une lamelle.
   2. Conserver à 4 °C dans l’obscurité jusqu’au moment de prendre l’image.
      note: Comme alternative, marquez d’abord les noyaux avec du DAPI ou un colorant Hoechst 33324 dilué à 1:2 000 dans du PBS à RT, puis montez avec du glycérol.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Alexa fluor 488-chèvre anticorps secondaire anti-lapin	Invitrogen	A-11034
Montage anti-décoloration avec DAPI	Invitrogen	Réf. P36931
Albumine sérique bovine	sigma	A2153
Lamelles	Marque Fisher	12-545-E
cryostat	Leica	CM1850
Edta	sigma	E6758
Microscope à fluorescence	Olympe	BX51
Lames de microscope	Marque Fisher	Référence 12-550-15
Composé OCT	Fisher Healthcare	Tél. : 23-730-571
Paraformaldéhyde (PFA)	sigma	Réf. P6148
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	sigma	Réf. P4417
Polyéthylène glycol tert-octylphényléther	sigma	Réf. T9284	Triton X-100
Anticorps anti-Ki67 de lapin	Technologie de signalisation cellulaire	Référence 9129	Lot # :3 ; Numéro RRID : AB_2687446
Anticorps anti-pSmad1/5/9 de lapin	Technologie de signalisation cellulaire	Référence 13820	Lot # :3 ; RRID : AB_2493181
Citrate de sodium	sigma	1613859
Tris	sigma	10708976001