Visualisation des motilités vésiculaires dans les neurones à l’aide de l’imagerie par fluorescence

Résumé

Source : Tsuruta, F., et al. Quantification des motilités des endosomes et des lysosomes dans les neurones en culture à l’aide de sondes fluorescentes. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo montre comment les vésicules neuronales sont marquées avec des protéines fluorescentes spécifiques pour visualiser leur mouvement. Tout d’abord, un plasmide codant pour une protéine fluorescente est incubé avec un agent de transfection, puis introduit dans une culture de neurones. Par la suite, des images des neurones sont acquises et analysées pour suivre le mouvement des vésicules.

Protocole

1. Imagerie de la motilité des vésicules

1. Préparez les plasmides qui marqueront chaque type de vésicule. Par exemple, utilisez EGFP-Rab5 pour les endosomes précoces, EGFP-Rab7 pour les endosomes tardifs, LAMP-EGFP pour les lysosomes et EGFP-LC3 pour les autophagosomes.
   note: Ces plasmides sont disponibles sur demande auprès de tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp. En règle générale, des neurones in vitro (Division ou DIV) de 3 à 5 jours peuvent être transfectés avec ces plasmides à l’aide de réactifs de transfection.
2. Mélangez 4,0 μg de plasmides avec 200 μL de milieu sans sérum par pipetage. Dans un tube sép....

Résultats

Figure 1 : Motilité des lysosomes dans les dendrites neuronales. (A) Les neurones corticaux de souris (4 DIV) ont été transfectés avec le plasmide LAMP-EGFP pendant 2 jours. Cette image montre la motilité des vésicules contenant LAMP-EGFP dans les dendrites. L’encart montre l’image en accéléré des vésicules positives de LAMP-EGFP. La pointe de flèche rouge indique une vésicule en mouvement et .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Milieu neurobasal	Thermo Fisher	Référence 21103-049
Opti-MEM	Thermo Fisher	31985070	Milieu sans sérum
Pénicilline Streptmycine	Thermo Fisher	15140122
L-Glutamine	Thermo Fisher	25030081
Suppléments de B-27	Thermo Fisher	17504044
bromhydrate de poly-D-lysine	sigma	P7280
poly-L-ornithine	sigma	Réf. P4957
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	11668027	Réactif de transfection
Polyéthylèneimine « Max »	Polysciences	Référence 24765	Réactif de transfection. Comme alternative à la lipofectamine2000, 0,1 mg/ml de polyéthylèneimine dissoute dans de l’eau stérilisée est disponible. Mais c’est une faible efficacité et une toxicité élevée.
BIOREVO BZ-9000	Cléence	Na
Système d’incubation INUG2-K13	Tokay Hit	Na
GraphPad Prism version 6.0	Logiciel GraphPad	Na
Excel version 15	Microsoft	Na
ImageJ verion 1.47	Na	Na