Visualisation des motilités vésiculaires dans les neurones à l’aide de l’imagerie par fluorescence

Abstract

Source : Tsuruta, F., et al. Quantification des motilités des endosomes et des lysosomes dans les neurones en culture à l’aide de sondes fluorescentes. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo montre comment les vésicules neuronales sont marquées avec des protéines fluorescentes spécifiques pour visualiser leur mouvement. Tout d’abord, un plasmide codant pour une protéine fluorescente est incubé avec un agent de transfection, puis introduit dans une culture de neurones. Par la suite, des images des neurones sont acquises et analysées pour suivre le mouvement des vésicules.

Protocol

1. Imagerie de la motilité des vésicules

1. Préparez les plasmides qui marqueront chaque type de vésicule. Par exemple, utilisez EGFP-Rab5 pour les endosomes précoces, EGFP-Rab7 pour les endosomes tardifs, LAMP-EGFP pour les lysosomes et EGFP-LC3 pour les autophagosomes.
   note: Ces plasmides sont disponibles sur demande auprès de tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp. En règle générale, des neurones in vitro (Division ou DIV) de 3 à 5 jours peuvent être transfectés avec ces plasmides à l’aide de réactifs de transfection.
2. Mélangez 4,0 μg de plasmides avec 200 μL de milieu sans sérum par pipetage. Dans un tube séparé, diluer 8 μL de réactif de transfection (voir tableau des matériaux) dans 200 μL de milieu sans sérum. Incuber pendant 5 minutes à température ambiante (RT).
3. Mélangez la solution plasmidique et la solution de régent de transfection à l’étape 1.2 par pipetage. Incuber pendant 20 min à RT.
4. Ajouter un milieu sans sérum et 400 μL de la solution plasmidique de l’étape 1.3 dans chaque plat à fond de verre revêtu contenant des neurones corticaux et un milieu de culture cortical cérébral. Incuber les neurones à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ pendant 30 min. Remplacer le milieu par 2 mL de milieu de culture cortical cérébral. Incuber les neurones à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ pendant 1 à 2 jours.
   note: Préparez un milieu de culture corticale cérébral composé d’un milieu basal neuronal complété par 1 supplément de B-27, 2 mM de L-glutamine et 100 U/mL de pénicilline-streptomycine.
5. Après 1 à 2 jours de transfection, sélectionnez les cellules transfectées pour l’acquisition d’images.
   note: Les neurones prématurés inférieurs à 7 DIV ont tendance à présenter une motilité vésiculaire dynamique. Sélectionnez les neurones qui expriment modérément la sonde de fluorescence, car il est impossible d’obtenir des images claires lorsqu’un neurone fortement exprimant est sélectionné. Sélectionnez également une forme neuronale typique, telle que des neurones pyramidaux, qui ont de longs axones et des dendrites complexes, pour faciliter l’identification de l’axone et des dendrites (voir Figure 1A).
6. Acquisition d’images à l’aide d’un système d’imagerie time-lapse : Pour l’imagerie, utilisez un microscope à fluorescence équipé d’une caméra CCD (Charge-Coupled Device) avec des objectifs 40X Plan Apo 0.95NA ou 100X Plan Apo VC NA1.4. Contrôlez la température à 37 °C à l’aide d’un système d’incubation. Acquérir des images de neurones à une image/5 s sur une période de 100 s contrôlée par le logiciel d’acquisition d’images. Vous pouvez également acquérir des images à des intervalles plus courts et pendant des périodes plus longues, par exemple à raison d’une image toutes les 2 s sur une période de 300 s.
   note: Il existe une variété d’applications pour la prise d’images séquentielles, dont beaucoup conviendraient à cette méthode. Par conséquent, aucune application particulière n’est recommandée ; Au lieu de cela, chaque chercheur devrait utiliser l’application disponible.

2. Analyse d’images

1. Ouvrez toutes les images séquentielles dans le logiciel ImageJ avec Manual Tracking.
   note: À ce jour, le suivi manuel a été largement utilisé dans les expériences de suivi. Le suivi manuel a été développé par le Dr Fabrice Cordelières. Des instructions écrites détaillées sont disponibles en ligne. Pour l’analyse, la qualité des données d’imagerie est améliorée avec un nombre suffisant d’images. Il est recommandé d’utiliser plus de 20 images.
2. Pour combiner les images séquentielles, choisissez → → . Cliquer.
3. Choisissez → ; une fenêtre de suivi apparaîtra.
4. Cliquez sur la case à cocher et définissez les paramètres de suivi dans la section des paramètres.
   note: Plusieurs paramètres peuvent être définis, notamment l’intervalle de temps, l’étalonnage x/y, l’étalonnage z, la taille du carré de recherche pour le centrage, la taille du point, la largeur de la ligne et la taille de la police. Dans ce test simplifié, l’intervalle de temps et l’étalonnage x/y ont été définis. Dans d’autres circonstances expérimentales, il peut être nécessaire de définir également d’autres paramètres. Les paramètres utilisés ici sont les suivants : la est de 5 s et la est soit de 0,26642 μm pour un objectif Plan Apo 0,95NA 40X, soit de 0,10657 μm pour un objectif Plan Apo VC NA1.4 100X.
5. Une fois les paramètres définis, cliquez sur pour démarrer une nouvelle piste.
6. Après avoir déterminé les vésicules d’intérêt (par exemple, les vésicules indiquées par des pointes de flèches bleues et rouges dans la figure 1A (panneau de droite)), cliquez sur le centre des signaux dans les images séquentielles pour enregistrer les coordonnées xy. Les résultats des coordonnées xy, de la distance et de la vitesse enregistrées s’affichent dans une nouvelle fenêtre.
   note: Dans le cas des lysosomes, de grands signaux fluorescents brillants (par exemple, Figure 1A (panneau de droite), pointe de flèche orange) sont souvent observés dans les neurones. Ces signaux présentent parfois soit des vésicules accumulées, soit des varicosités pathologiques, de sorte que ces signaux doivent être évités pour quantifier la motilité.
7. Répétez l’étape 2.6 pour collecter les coordonnées xy des vésicules à partir de toutes les images séquentielles ; une fois le point de référence sélectionné, chaque image passe automatiquement à l’image successive.
8. Exportez ces données vers une nouvelle table (par exemple, une feuille de calcul). Utilisez un logiciel approprié pour créer un graphique approprié (voir la table des matériaux).
   note: Pour analyser les données, sélectionnez la colonne, additionnez toutes les valeurs de cette colonne et affichez une distance de motilité sous forme de graphique à barres, comme dans la figure 1B. De plus, répétez cette étape, calculez la moyenne de la distance de motilité totale et montrez-la sous forme de graphique à barres, comme dans la figure 1C. Le logiciel permettant de créer un graphique à barres et des données de forme d’onde est présenté dans la table des matériaux.

Results

Figure 1 : Motilité des lysosomes dans les dendrites neuronales. (A) Les neurones corticaux de souris (4 DIV) ont été transfectés avec le plasmide LAMP-EGFP pendant 2 jours. Cette image montre la motilité des vésicules contenant LAMP-EGFP dans les dendrites. L’encart montre l’image en accéléré des vésicules positives de LAMP-EGFP. La pointe de flèche rouge indique une vésicule en mouvement et ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Milieu neurobasal	Thermo Fisher	Référence 21103-049
Opti-MEM	Thermo Fisher	31985070	Milieu sans sérum
Pénicilline Streptmycine	Thermo Fisher	15140122
L-Glutamine	Thermo Fisher	25030081
Suppléments de B-27	Thermo Fisher	17504044
bromhydrate de poly-D-lysine	sigma	P7280
poly-L-ornithine	sigma	Réf. P4957
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	11668027	Réactif de transfection
Polyéthylèneimine « Max »	Polysciences	Référence 24765	Réactif de transfection. Comme alternative à la lipofectamine2000, 0,1 mg/ml de polyéthylèneimine dissoute dans de l’eau stérilisée est disponible. Mais c’est une faible efficacité et une toxicité élevée.
BIOREVO BZ-9000	Cléence	Na
Système d’incubation INUG2-K13	Tokay Hit	Na
GraphPad Prism version 6.0	Logiciel GraphPad	Na
Excel version 15	Microsoft	Na
ImageJ verion 1.47	Na	Na