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Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Immunofluorescence
- Préparez des solutions comprenant le tampon de blocage, le tampon d’anticorps, le tampon de lavage 1 et le tampon de lavage 2 (voir le tableau 1).
- Rincez les tranches une fois avec un tampon de phosphate (PB) pour éliminer l’excès de composé à température de coupe optimale (OCT).
- Retirez la solution à l’aide d’une pipette en plastique sans aspirer les tranches de cerveau. Ajouter 250 μL de PB frais à l’aide d’une pipette de 1000 μL.
prudence: Les tranches ne doivent pas se dessécher, alors retirez-les et ajoutez-les bien par bien.
- Retirez le PB à l’aide d’une pipette en plastique et ajoutez 250 μL de tampon de blocage par puits avec une pipette de 1000 μL. Incuber pendant 3 h à température ambiante (RT) sur l’agitateur.
- Pendant le temps d’incubation, diluez les anticorps primaires dans un tampon d’anticorps dans un tube réactionnel. Utilisez un tampon d’anticorps de 250 μL par puits et ajoutez la quantité appropriée d’anticorps (voir le tableau 2) en le pipetant directement dans la solution à l’aide d’une pipette de 2 μL. Mélangez la solution en pipetant doucement de haut en bas plusieurs fois. Vortex peu de temps après pour assurer un bon mélange.
note: Pour déterminer la fluorescence de fond, la coloration doit également être effectuée sans ajout de l’anticorps primaire. Pour cela, incubez la tranche dans une solution d’anticorps sans anticorps primaires selon le protocole.
- Après le temps d’incubation, retirez le tampon de blocage à l’aide d’une pipette en plastique et ajoutez 250 μL de solution d’anticorps contenant des anticorps primaires par puits. Incuber des tranches avec l’anticorps primaire pendant une nuit à 4 °C sur un agitateur.
- Le lendemain, lavez les tranches avec un tampon de lavage 1 3x pendant 10 min à RT sur un shaker.
- Retirez le milieu à l’aide d’une pipette en plastique et ajoutez 300 μL de tampon de lavage 1 par puits. Incuber à RT pendant 10 min. Répétez l’opération 3 fois.
- Pendant les étapes de lavage, diluez les anticorps secondaires couplés aux fluorophores dans un tampon d’anticorps dans un tube réactionnel. Utilisez un tampon d’anticorps de 250 μL par puits et ajoutez la quantité appropriée d’anticorps (voir le tableau 2) en le pipetant directement dans la solution à l’aide d’une pipette de 2 μL. Mélangez la solution en pipetant doucement de haut en bas plusieurs fois. Vortex peu de temps après pour assurer un bon mélange.
prudence: Comme les anticorps sont sensibles à la lumière, toutes les étapes à partir de ce moment doivent être effectuées dans l’obscurité.
- Après les étapes de lavage, retirez le tampon de lavage à l’aide d’une pipette en plastique et ajoutez 250 μL de solution d’anticorps contenant des anticorps secondaires par puits. Incuber les tranches avec l’anticorps secondaire pendant 90 min à RT dans l’obscurité.
- Lavez les tranches avec le tampon de lavage 2 3x pendant 10 min à RT.
- Pendant les étapes de lavage, diluer le 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dans 0,1 M PB à une concentration de 1:2000.
- Retirez le tampon de lavage 2 à l’aide d’une pipette en plastique et ajoutez 250 μL de solution DAPI par puits. Incuber pendant 5 min à RT sur le shaker.
- Retirer la solution DAPI à l’aide d’une pipette en plastique et ajouter 500 μL de 0,1 M PB par puits à l’aide d’une pipette de 1000 μL.
- Montez des tranches sur des lames de microscope.
- Placez une lame de microscope sous le stéréoscope. À l’aide d’un pinceau fin, ajoutez trois gouttes distinctes de 0,1 M PB sur la lame. Placez une tranche par goutte sur la lame du microscope.
- À l’aide du pinceau fin, aplatissez et orientez les tranches sur la lame de microscope.
- Lorsque toutes les tranches sont correctement positionnées, retirez l’excès de PB à l’aide d’un mouchoir en papier et séchez soigneusement la lame.
prudence: Évitez de sécher complètement les tranches de cerveau.
- Ajouter 80 μL de milieu d’enrobage sur la lame. Abaissez soigneusement la lamelle sur la glissière, intégrant ainsi les tranches de cerveau.
- Laissez sécher les lames dans la hotte pendant 1 à 2 h (couvrez-les pour éviter l’exposition à la lumière) et rangez-les dans une boîte à lames de microscope à 4 °C
note: Le protocole peut être mis en pause ici.
2. Imagerie
- Une fois que le milieu d’enrobage est complètement durci, placez la lame de microscope sous le microscope confocal.
note: La microscopie à épifluorescence combinée à un logiciel de déconvolution devrait donner une qualité d’image similaire.
- Ajustez les paramètres laser en augmentant ou en diminuant l’intensité du laser pour chaque canal afin que peu de pixels soient surexposés pour assurer une distribution maximale des valeurs de gris.
- Acquérez des tissus virtuels de la tranche de cerveau entière pour les différents canaux.
- Dans le logiciel d’imagerie, sélectionnez l’option Tuiles et délimitez manuellement la tranche de cerveau à l’aide de la configuration de la région de tuiles.
- Répartissez les points d’appui dans toute la région de la tuile et ajustez la mise au point des différents points d’appui en appuyant sur Vérifier les régions/positions des tuiles....
- Ajustez les paramètres du mode d’acquisition en fonction de la résolution souhaitée et de la taille du fichier de l’image résultante, puis lancez la numérisation.
- Une fois le scan terminé, utilisez la fonction Stitching pour traiter le tissu virtuel. Exportez le fichier en tant que .tif avec la fonction Exportation d’image.
3. Analyse assistée par ordinateur
- Chargez toutes les couches uniques d’une image dans FIJI en cliquant sur Fichier| Ouvrez.
- À l’aide de l’outil de sélection à main levée, délimitez un hémisphère dans le canal DAPI. Créez un masque de la sélection en cliquant sur Modifier| Sélection| Créez un masque.
- Déterminez l’intensité moyenne de fluorescence pour les canaux uniques (Mover et synaptophysine) en cliquant sur Analyser| Mesure.
note: Assurez-vous de sélectionner les différents canaux pour déterminer les valeurs moyennes d’intensité de fluorescence pour chaque canal.
- Copiez l’intensité moyenne de fluorescence pour les canaux individuels dans une feuille de calcul.
- Déterminez l’intensité moyenne de fluorescence pour les canaux individuels d’une zone d’intérêt en délimitant également la zone à l’aide de l’outil de sélection à main levée. Utilisez un atlas de cerveau de souris comme référence.
- Répétez les étapes 3.1 à 3.5 pour tous les hémisphères et toutes les zones d’intérêt.
note: Déterminez les valeurs de chaque hémisphère séparément afin de comparer ultérieurement les valeurs d’une zone d’intérêt à celles de l’hémisphère (voir étape 4.2).
4. Traitement des données
- Dans le cas où la fluorescence de fond est élevée, une soustraction d’arrière-plan peut être nécessaire. Pour cela, déterminez l’intensité moyenne de fluorescence de la tranche traitée sans anticorps primaire contre la protéine de référence (ici : synaptophysine) et soustrayez cette valeur de toutes les valeurs obtenues pour les régions et les hémisphères du cerveau.
- Lorsque les intensités de fluorescence moyennes pour les canaux simples pour chaque hémisphère et chaque zone d’intérêt ont été déterminées (voir le tableau 3), calculez le rapport entre Mover et la synaptophysine en divisant la valeur de Mover par la valeur de synaptophysine (en jaune dans le tableau 3). Effectuez cette action pour chaque hémisphère et chaque zone d’intérêt séparément.
- Divisez le rapport obtenu pour une zone d’intérêt par le rapport obtenu pour l’hémisphère correspondant (orange dans le tableau 3) pour déterminer le rapport entre la zone d’intérêt et l’hémisphère.
- Pour déterminer l’abondance relative des Mover, traduisez le rapport obtenu en 4.2 en pourcentage en déterminant son écart par rapport à 1 (en rouge dans le tableau 3). Un ratio de 1,25 donnerait donc une abondance relative de 25 % au-dessus de la moyenne, et un ratio de 0,75 donnerait une abondance relative de 25 % inférieure à la moyenne.
Tableau 1 : Solutions utilisées dans ce protocole.
| Fixateur (500mL) |
Mélange 20g de paraformaldéhyde (concentration totale : 4 %)
50 mL 10x solution mère PBS (concentration totale : 1x)
450 mL bidest H2OAdjust pH à 7,4 avec NaOH
Remarque : Pour résoudre le paraformaldéhyde dans le PBS, chauffez la solution. Ne chauffez pas à plus de 70 °C, car le PFA se désintègre à des températures supérieures à 70 °C
Attention : Le PFA est toxique, potentiellement cancérigène et tératogène. Portez des gants lorsque vous travaillez avec du PFA et travaillez sous la hotte. Évitez l’ingestion. |
| 0.1M PB (1L) |
Solution mère X
35,61 g Na2HPO4,2H 2O dans 1 L bidest H2O | Solution mère Y
27,60 g NaH2PO4,2H 2O en 1 L bidest H2O |
Mix 385 mL solution mère X
115 mL de solution mère Y
500 mL bidest H2O |
| Tampon de blocage (50 mL) |
Mélange 1,25 mL de sérum de chèvre normal (concentration totale : 2,5 %)
1,25 mL de sérum d’âne normal (concentration totale : 2,5 %)
0,5 mL de tensioactif non ionique (Triton-X100, concentration totale : 1 %)
47 mL 0,1 M PB |
| Tampon d’anticorps (50 mL) |
Mélange 0,25 mL de sérum de chèvre normal (concentration totale : 0,5 %)
0,25 mL de sérum d’âne normal (concentration totale : 0,5 %)
0,1 mL de tensioactif non ionique (concentration totale : 0,2 %)
49,4 mL 0,1 M PB |
| Tampon de lavage 1 (50 mL) |
Mélanger 1 mL de sérum de chèvre normal (concentration totale : 2 %)
49 mL 0,1 M PB |
| Tampon de lavage 2 (50 mL) |
Mélange 0,5 mL de sérum de chèvre normal (concentration totale : 1 %)
49,5 mL 0,1 M PB |
Tableau 2 : Anticorps utilisés dans ce protocole.
| Anticorps primaires |
| Dirigé contre | Espèces hôtes | RRID | concentration |
| déménageur | lapin | AB_10804285 | 1:1000 |
| Synaptophysine | cobaye | AB_1210382 | 1:1000 |
| Anticorps secondaires |
| Espèces cibles | Espèces hôtes | Fluorophore | concentration |
| lapin | âne | AlexaFluor 647 | 1:1000 |
| cobaye | chèvre | AlexaFluor 488 | 1:1000 |
Tableau 3 : Exemple de traitement des données.
| hémisphère |
| Hémisphère # | Intensité moyenne de fluorescence Synaptophysine (U.A.) | Intensité moyenne de fluorescence Mover (A.U.) | Rapport moteur/synaptophysine | | |
1
2
3
4
5
6 | 29.134
31.008
38.641
30.775
21.658
27.277 | 22.810
24.046
29.324
25.444
18.091
23.364 | =C3/B3 0,783
=C4/B4 0,775
=C5/B5 0,759
=C6/B6 0,827
=C7/B7 0,835
=C8/B8 0,857 | | |
| Hippocampe |
| Hémisphère # | Intensité moyenne de fluorescence Synaptophysine (U.A.) | Intensité moyenne de fluorescence Mover (A.U.) | Rapport moteur/synaptophysine | Rapport à l’hémisphère | Abondance relative des déménageurs ( %) |
1
2
3
4
5
6 | 35.26
33.955
41.231
39.853
30.129
28.737 | 29.889
27.825
31.978
31.787
27.817
25.861 | =C11/B11 0,848
=C12/B12 0,819
=C13/B13 0,776
=C14/B14 0,798
=C15/B15 0,923
=C16/B16 0,900 | =D11/D3 1.083
=D12/D4 1.057
=D13/D5 1.022
=D14/D6 0.965
=D15/D7 1.105
=D16/D8 1,051 | =(E11-1)*100 8.269
=(E12-1)*100 5.673
=(E13-1)*100 2.200
=(E14-1)*100 -3.528
=(E15-1)*100 10.530
=(E16-1)*100 5.064 |