Évaluation de l’intégrité structurelle des jonctions neuromusculaires longitudinales dorsales chez la drosophile

1. Congélation instantanée et bissection du thorax

1. Avant de commencer les bissections, remplissez une fiole de Dewar d’azote liquide à l’aide de gants de cryoprotection et de lunettes de sécurité appropriés. Obtenez un brise-lame, des lames de plumes, une paire de pinces fines, de la glace, du PBS 1x glacé et une pince à épiler cryogénique.
2. Préparez un seau à glace pour garder 1x glace PBS froide.
3. Utilisez le brise-lame pour saisir la lame de la plume en biais et pliez la lame afin de casser un petit morceau. Le brise-lame peut alors verrouiller la lame en position pour l’utiliser comme un petit scalpel.
   note: Une lame devrait durer pour tous les groupes. Changez si la lame se casse ou s’émousse.
4. Ajoutez une pointe de pipette propre sur le P200 et retirez 1/5e de la pointe pour transporter les échantillons.
5. Préparez un nouveau tube de microcentrifugation pour chaque groupe et ajoutez 200 μL de 1x PBS dans chaque tube. Ce deuxième tube sera utilisé pour collecter les préparations finales du DLM.
6. Retirez tous les 1x PBS des tubes à l’aide d’une pipette Pasteur.
7. En portant un équipement de protection approprié, immergez le tube dans la fiole d’azote liquide pendant 10 s à l’aide de la pince cryogénique.
   note: Les tubes doivent être fermés hermétiquement pour éviter qu’ils n’explosent.
8. Retirez le tube de l’azote liquide et ajoutez environ 300 μL de PBS 1x glacé aux échantillons à l’aide d’une pipette Pasteur. Conservez les échantillons sur de la glace.
9. Ajoutez du PBS 1x glacé dans la boîte de dissection de 10 cm recouverte d’élastomère de silicone et distribuez le premier thorax avec la pipette modifiée de 200 μL.
10. Placez le thorax côté ventral vers le haut. Dans une main, utilisez une paire de pinces émoussées pour positionner le thorax et dans l’autre, utilisez une paire de pinces fines pour retirer une partie du ganglion thoracique afin d’exposer la ligne médiane du thorax.
11. Utilisez la ligne médiane du thorax comme guide pour faire une coupe peu profonde à travers 1/3 du thorax avec la lame.
12. Retirez la lame du thorax et positionnez le thorax à un angle de 45° avec la pince émoussée. Réinsérez la lame et coupez directement la ligne médiane du thorax. Cela se traduira par deux hémitoraces.
13. Prenez un hémithorax à la fois et retirez l’excès de tissu sous la fibre musculaire DLM F (Figure 1B), la fibre la plus ventrale. Utilisez la lame pour effectuer soigneusement une ou deux coupes afin d’enlever l’excès de tissu sans endommager les DLM.
14. Une fois isolé, transférez l’hémithorax dans le bon tube avec 1x PBS.
15. Répétez les étapes 1.6\u20121.14 jusqu’à ce que 10 hémithoraces disséqués par groupe soient réalisés.

2. Coloration structurelle

1. Après avoir coupé en deux les échantillons de thorax, placez le tissu dans un tampon de blocage (1x PBS avec 0,1 % de sérum de chèvre normal et 0,2 % de Triton X-100 à pH 7,4) pour perméabiliser le tissu et éviter les colorations non spécifiques. À l’aide d’une pipette Pasteur, retirez l’excédent de 1 PBS et ajoutez 1,5 ml de tampon de blocage dans chaque tube. Bloquez les tissus pendant au moins 1 h à 4 °C.
2. Préparez les échantillons pour la coloration structurelle à l’aide d’un anticorps conjugué par fluorescence, la peroxydase de raifort 488 (anti-HRP-488) à une dilution de 1:200 et la phalloïdine-647 à une dilution de 1:1000 dans un tampon de blocage pour colorer les motoneurones et le tissu musculaire, respectivement. Faites suffisamment de teinture pour avoir 150 μL par tube. Conservez la teinture à 4 °C recouverte d’une feuille d’aluminium ou dans une boîte sombre jusqu’à ce qu’elle soit prête à teindre.
3. Après le blocage, retirez l’excès de tampon de blocage à l’aide d’une pipette Pasteur en verre.
4. Avant de distribuer la teinture structurelle, vortex la teinture. Ajouter 150 μL de colorant dans chaque tube. Placez les échantillons dans une boîte sombre sur le rotateur à température ambiante pendant 2 h.
5. Enlevez la tache et lavez les mouchoirs quatre fois dans 1,5 mL de température ambiante 1x PBS avec 0,3 % Triton X-100 pendant 5 min sur le rotateur dans une boîte sombre. Les échantillons sont maintenant prêts à être montés sur une lame.

3. Montage du tissu

1. Après avoir lavé les échantillons dans PBST, préparez une lame de microscope pour monter le tissu à colorer. Préparez des fournitures supplémentaires, notamment des lamelles en verre, une pipette P200, des pointes de pipette de 200 μL, des ciseaux, des renforts transparents, des pinces à bord droit, un support de montage fluorescent anti-décoloration, du vernis à ongles et une boîte sombre pour couvrir les lames.
2. Étiquetez la lame pour identifier les échantillons et nettoyez-la avec des lingettes Kim pour enlever toute tache.
3. Pour s’assurer que la lamelle n’endommage pas les échantillons d’hémithorax, construisez un « pont » à l’aide d’étiquettes de renforcement. Coupez une étiquette de renfort en deux et placez chaque moitié à environ 15 mm d’intervalle. Cette distance doit être inférieure à la largeur de la lamelle. Répétez cette étape quatre fois pour compléter un « pont » de 5 étiquettes de haut.
4. Prenez la pipette P200 et modifiez une pointe en coupant 1/5e de la pointe pour transférer les échantillons sur la lame. Les échantillons doivent être transférés sur la lame au centre du pont.
5. Prenez le bord d’une lingette de laboratoire et retirez tout excès de PBST. À l’aide d’une pince, disposez les DLM de manière à ce que tous les échantillons soient orientés vers le haut et vers le bas, côté cuticule vers le bas.
6. À l’aide d’une pointe de pipette standard P200, appliquez 70 μL de support de montage sur la lame, en évitant les bulles d’air. Distribuez le support selon un schéma circulaire à l’intérieur des renforts, en commençant par l’extérieur vers le centre.
7. Placez une lamelle sur les renforts.
8. Utilisez du vernis à ongles pour recouvrir les bords extérieurs sur le pourtour de la lamelle. Appliquer généreusement pour former une étanchéité complète du tissu.
9. Placez la lame sur une surface plane dans l’obscurité, en laissant sécher au moins 10 minutes et en évitant le photoblanchiment ou la perte de fluorescence. Les lames peuvent désormais être utilisées immédiatement pour l’imagerie, ou stockées dans un dossier de diapositives à -20 °C pour une visualisation ultérieure.

Graphique 1 : Dénervation progressive des synapses DLM dans un modèle de drosophile de la SLA. (A) La génération de mouches transgéniques ALS exprimant une forme mutante humaine de la protéine de liaison au goudron de 43 kDa (TDP-43) est illustrée dans le schéma. (B) L’illustration représente la forme et l’orientation d’un hémithorax chez une drosophile adulte. En utilisant le protocole, nous pouvons observer la perte progressive de l’intégrité synaptique des synapses DLM NMJ par coloration structurelle des motoneurones avec HRP (vert) et du tissu musculaire avec Phalloidin (magenta). Notre modèle décrit la perte d’intégrité synaptique dans un modèle adulte de SLA par la génération de mouches adultes exprimant un mutant de TDP-43M337V humain dans les motoneurones (Figure 1F\u2012H) par rapport aux mouches WT (Figure 1C\u2012E) dans la fibre musculaire C. Les flèches mettent en évidence des exemples de synapse WT (Figure 1C) et un exemple de perte d’intégrité synaptique. Barre d’échelle = 20 μm à un grossissement de 63x.