Étude d’une lésion cérébrale d’une larve de poisson-zèbre à l’aide de la microscopie électronique à transmission à balayage à grande échelle

1. Préparation des échantillons

1. Fixation et encastrement
   1. fixation
      1. Anesthésier les larves de poisson zèbre dans de l’eau de poisson zèbre (0,003 %) ajoutées à l’eau E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO_4, 10 mM HEPES, pH 7,6) et tester la profondeur de l’anesthésie en piquant doucement avec une pointe de pipette de 200 μl sous un microscope de dissection jusqu’à ce qu’aucun mouvement ne soit détecté (figure 1A).
      2. Lors du traitement d’échantillons pour la microscopie électronique corrélative (ME) après avoir acquis des données d’imagerie in vivo à l’aide de l’imagerie confocale ou à 2 photons dans de l’agarose à 1,8 % comme décrit, fixer les larves dans l’agarose à l’aide de 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant du Triton-X-100 (0,05 %).
      3. Couper les larves de l’agarose et procéder à des EM à grande échelle.
      4. Fixer les larves dans du paraformaldéhyde frais à 4 % dans du PBS contenant du Triton-X-100 (0,05 %) pendant 2 heures à température ambiante dans des tubes en plastique.
         note: Les cellules cultivées en culture (in vitro) peuvent être directement fixées dans le glutaraldéhyde, comme décrit à l’étape suivante (1.1.1.5).
      5. Retirer la solution et ajouter 100 μl de PFA à 0,5 %, 2 % de glutaraldéhyde (GA) et 0,1 M de cacodylate de sodium (pH 7,4). Conserver toute la nuit à 4 °C. Rincer deux fois les échantillons avec du cacodylate de sodium 0,1 M.
      6. Coupez les têtes larvaires en rostral jusqu’au cerveau postérieur pour faciliter la pénétration de l’osmium. Utilisez des seringues/pinces fines.
      7. Postfixer les larves dans du tétroxyde d’osmium à 1 % (OsO₄)/du ferrocyanure de potassium à 1,5 % (K₄[Fe(CN)₆]) dans du cacodylate de sodium à 0,1 M sur glace pendant 2 h et rincer 3 x 5 min dans du H₂O distillé deux fois.
      8. Déshydrater dans l’éthanol par incubation de 20 minutes à des concentrations croissantes d’éthanol (50 %, 70 %, 3 fois 100 %).
   2. encastrement
      1. Préparez la résine époxy selon les recettes standard utilisées dans les laboratoires EM.
         note: Nous utilisons la résine époxy comme suit : mélangez 19,8 g d’éther glycidique 100, 9,6 g d’anhydride d’acide 2-dodécénylsuccinique et 11,4 g d’anhydride méthylnadique à l’aide d’un agitateur magnétique. Ajouter 0,5 g de DMP-30 (tris-(diméthylaminométhyl)phénol) et mélanger à nouveau.
      2. Incuber les larves pendant la nuit dans de la résine époxy à 50 % dans de l’éthanol (v/v) en rotation (RT).
      3. Remplacez la résine époxy diluée par de la résine pure. Incuber pendant 30 min, ajouter à nouveau de la résine fraîche et incuber encore 30 min. Rafraîchissez à nouveau la résine puis incubez 3 heures à la RT, puis 15 min à 58 °C et encore 1 heure à la RT sous basse pression (200 mbar).
      4. Orientez les têtes dans des moules à encastrement plat en silicone disponibles dans le commerce sous un microscope de dissection à l’aide d’une aiguille ou d’un cure-dent, l’antérieur faisant face au côté du moule ou au besoin (Figure 1B).
      5. Polymériser la résine époxy pendant la nuit à 58 °C. Si la résine époxy est encore trop molle, laissez un autre jour polymériser et durcir à 58 °C. Testez la rigidité en appliquant une pression à l’aide d’une pince. Si cela laisse facilement une indentation, laissez un autre jour pour polymériser et durcir à 58 °C. Lorsque l’échantillon est complètement durci, procédez à la taille et au sectionnement.
      6. Coupez l’excès de résine du bout à l’aide de lames de rasoir (Figure 1B).
2. Sectionnement, contraste et montage
   1. sectionnement
      1. Sectionnez le bloc de résine époxy à l’aide d’un ultramicrotome.
      2. À l’aide d’un couteau en verre ou d’un histoknife en diamant, coupez des sections semi-minces (500 nm) pour une coloration bleu toluidine/fuchsine basique (figure 1D) afin de détecter le bon positionnement.
      3. Transférez des lames semi-minces sur des lames microscopiques en les prélevant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre dont l’extrémité a été fermée par fusion à la flamme. Sécher sur une plaque chauffante jusqu’à ce qu’il ne reste plus d’eau. Teindre pendant 10 sec avec 1 % de bleu de toluidine dans de l’eau sur une plaque chauffante, et après rinçage à l’eau, colorer pendant 10 sec avec 0,05 % de fuchsine basique dans 1 % de tétraborate de sodium. Examinez avec un microscope à lumière normale de 10X à 40X.
      4. Lorsque le site/l’orientation appropriés dans le cerveau est atteint, continuez à sectionner le bloc de résine époxy avec un couteau diamanté pour couper des sections ultraminces (~ 70 nm ; Graphique 1E)
      5. Utilisez des structures anatomiques facilement identifiables dans et autour du cerveau, y compris les fosses olfactives, les yeux et les limites de la matière gris-blanc, pour identifier la région d’intérêt lors de la coupe ultramince et pour ajuster l’angle de section lorsque l’échantillon est incliné.
      6. Montez la section sur des grilles en cuivre L2 x 1 à fente unique (Figure 1F), pour permettre une acquisition ininterrompue par des barres de grille. Utilisez des grilles revêtues de Formvar pour soutenir les sections.
   2. contrasté
      1. Colorez des sections ultraminces sur des grilles pendant 2 minutes dans de l’acétate d’uranyle à 2 % dans du méthanol, suivi d’un citrate de plomb Reynolds pendant 2 minutes supplémentaires.

2. Acquisition d’images

1. Microscopie électronique à transmission à balayage à grande échelle (STEM)
   note: Nous utilisons l’EM de balayage avec un générateur de balayage externe capable d’acquérir plusieurs grands champs de vision à haute résolution en utilisant la détection STEM. En règle générale, une image générée de cette manière équivaut aux champs de vision de ~ 100 images au microscope électronique à transmission (MET), ce qui réduit considérablement la quantité d’assemblage.
   1. Montage de l’échantillon dans le microscope
      1. Placez la grille avec la section dans le porte-échantillon à grilles multiples et transférez-la dans la chambre du MEB.
   2. Alignement du détecteur STEM
      1. Placez la grille avec l’échantillon sous le faisceau et déplacez-la vers le haut de manière à ce qu’elle soit à environ 5 mm du pôle de l’objectif. Acquérez une image à 20 kV à l’aide du détecteur intégré à l’objectif.
      2. Faites la mise au point sur le bord de la grille et ajustez la distance de travail à 4,0 mm.
      3. Déplacez le porte-échantillon dans une position sûre et entrez le détecteur STEM.
      4. Centrez le trou du détecteur STEM dans le champ d’image en tournant les vis de réglage tout en imageant à la vitesse maximale avec le détecteur intégré à l’objectif.
      5. Ramenez soigneusement le porte-échantillon qui s’adaptera juste entre le pôle de l’objectif et le détecteur.
      6. Acquérez une image avec le détecteur intégré à l’objectif pour vous assurer qu’elle se trouve sur la zone de la section.
      7. Passez à la détection STEM (gain moyen et tous les quadrants réglés sur « moins »), acquérez une image et sélectionnez la zone à balayer.
      8. Augmentez la tension d’accélération à 21 kV et attendez la stabilisation du faisceau (image stable à nouveau), puis passez à 29 kV par pas de 2 kV.
   3. Acquisition d’images
      1. Pré-irradiez l’échantillon (pour éviter les changements de luminosité causés par le faisceau électrique) en effectuant un zoom arrière afin que la zone complète à balayer s’adapte à la fenêtre de l’image.
      2. Changez l’ouverture à 120 μm (pour conserver la plage dynamique appropriée, les gains du détecteur doivent être réduits d’un pas).
      3. Défocalisez pour que l’image soit floue.
      4. Rendez la zone numérisée aussi étroite que possible à l’aide de l’option de balayage de zone réduite.
      5. Réglez la vitesse de numérisation de sorte qu’une image soit numérisée en env. 1 à 2 s.
         note: Selon la taille et le tissu, cela prend généralement 1/2 heure (champ de vision (FOV) de 100 x 100 μm) à jusqu’à 3 h (1 000 x 500 μm).
      6. Zoomez au moins 100X et balayez une petite zone pendant 10 sec.
         note: Lorsque cette zone ne change pas de luminosité par rapport à son environnement, la pré-irradiation est suffisante.
      7. Ramener l’ouverture de 30 μm (et le gain STEM sur medium)
      8. Concentrez-vous sur l’échantillon.
      9. Alignez l’ouverture à l’aide du wobbler (à un grossissement de ~ 40 000X).
      10. Lorsque la mise au point est nette, sélectionnez la zone/la fonction la plus claire et réglez la vitesse de balayage de manière à ce que les détails soient visibles.
      11. Dans le logiciel du microscope, ajustez la luminosité et le contraste en regardant attentivement l’histogramme pour garder tous les pixels dans la plage dynamique. Faites de même pour les zones/caractéristiques les plus sombres.
      12. Revenez à la zone lumineuse et vérifiez à nouveau. Soyez du bon côté afin qu’il y ait un peu d’espace des deux côtés de l’histogramme.
      13. Faites un zoom arrière pour que la zone complète à numériser s’adapte à la fenêtre d’imagerie et lancez le programme d’acquisition de grandes zones.
      14. Utilisez l’option de l’assistant pour configurer une mosaïque en sélectionnant une zone à l’écran. Utilisez une taille de pixel de 2 à 5 nm en fonction des détails nécessaires. Utilisez le temps d’arrêt de 3 μs pour STEM.
      15. Sélectionnez l’option « autofocus sur la tuile précédente », utilisez le logiciel d’acquisition à grande échelle autofocus avec les paramètres par défaut de l’entreprise, cochez la case « vérifier les paramètres avant l’exécution » et définissez où enregistrer les données.
      16. Appuyez sur « optimiser » pour vérifier les paramètres du microscope.
          note: Maintenant, le temps nécessaire sera indiqué. Cela peut aller jusqu’à 72 heures pour les zones de 1 x 0,5 mm.
      17. Dans la fenêtre, tapez « résolution maximale des tuiles » 20 000 afin que les tuiles individuelles ne dépassent pas 20k x 20k, évitant ainsi les effets de bord émoussés. Appuyez sur « exécuter ».
      18. Lorsqu’on vous demande de vérifier la mise au point et la luminosité/contraste (B/C), désactivez le générateur de balayage externe et ajustez soigneusement la mise au point et l’astigmatisme dans le logiciel du microscope. Ne pas modifier B/C.
          note: La platine peut être déplacée et le grossissement modifié, mais le grossissement doit être réglé à la taille de pixel souhaitée.
      19. Allumez à nouveau le générateur de balayage externe et appuyez sur « continuer ».

Figure 1 : Flux de travail de la microscopie électronique tissulaire à grande échelle sur des cerveaux de poissons-zèbres. (A)Larve de poisson-zèbre âgée de 7 jours. (B) Têtes de larves de poisson-zèbre noyées côte à côte dans de la résine époxy. (C) Couteau en verre pour la coupe semi-mince et l’orientation de l’échantillon. (D) Coupe représentative semi-mince colorée au bleu toluidine montrant deux larves de poisson-zèbre incrustées côte à côte. (E) Couteau diamanté pour couper des sections ultrafines (70 nm). (F) Image modifiée en (D) d’une coupe entière du cerveau d’une larve de poisson-zèbre sur une grille à un trou pour indiquer le positionnement. ( G) Système de microscopie utilisé pour l’EM 2D à grande échelle dans cette étude. (H) Flux de traitement de l’image.