Différenciation et maturation de cellules souches embryonnaires humaines en organoïdes neuraux

Résumé

Source : Cosset, E., et al. Organoïdes neuronaux humains pour l’étude du cancer du cerveau et des maladies neurodégénératives. J. Vis. Exp. (2019)

Dans cette vidéo, un protocole par étapes pour les cellules souches embryonnaires humaines dans les organoïdes neuraux est démontré. La méthode consiste à induire la formation de rosettes neuronales, suivie d’une maturation contrôlée et d’une culture finale sur une membrane hydrophobe pour obtenir des organoïdes neuronaux pleinement développés.

Protocole

1. Entretien et culture de cellules souches embryonnaires humaines indifférenciées (CSEh)

1. Effectuez la maintenance et l’expansion des hSECs dans des conditions sans alimentateur en pré-enrobant les boîtes d’une matrice extracellulaire spécifique.
   1. Décongelez 300 μL de matrice extracellulaire à 4 °C (concentration typique de 18 à 22 mg/mL, à conserver sur de la glace) et mélangez doucement avec 15 mL de DMEM froid (Dulbecco's Modified Eagle Medium) pour éviter la gélification prématurée de la matrice extracellulaire. Ajouter 7,5 mL de matrice extracellulaire dans les deux flacons T150.
   2. Incuber les plats recouverts de matrice extracellulaire à 37 °C pendant au moins 1 h (maximum pendant la nuit).
   3. Retirez le milieu et semez les CSEh à une densité de 6,5 x 104 cellules/cm².
2. Maintenir H1 (lignée cellulaire hESC) dans un milieu hESC et 1 % de pénicilline/streptomycine.
3. Passer les cellules avec la procédure enzymatique : ajouter 7,5 mL de solution enzymatique dans une fiole de T75 cm2 pendant une période de 1 à 2 min à 37 °C. Une fois les cellules complètement détachées, ajoutez 7,5 ml de DMEM-F12, puis centrifugez pendant 5 minutes à 300 x g. Pour permettre une meilleure survie, réarmez les cellules à la densité souhaitée sur des boîtes recouvertes de matrice extracellulaire, dans le même milieu contenant l’inhibiteur de la protéine kinase associée à Rho (ROCK) (10 μM) pendant 24 h.

2. organoïdes neuronaux dérivés de hESC

1. 24 h avant de commencer la culture 3D, remplacer le milieu hESC par un milieu sans sérum complété par un inhibiteur de ROCK 10 μM (les deux composants sont nécessaires pour soutenir la survie cellulaire et la formation spontanée de la neurosphère pendant la phase d’agrégation dans une plaque de micropuits). Les cellules doivent avoir une confluence de 60 %. Le lendemain (jour 0), détacher les colonies de CSEh en cellules uniques : retirer le milieu, rincer avec du PBS sans Ca²⁺/Mg²⁺, ajouter 5 mL de solution de dissolution enzymatique et incuber à 37 °C pendant 1 à 2 min.
2. Prélever les cellules dans un milieu sans sérum complété par 10 μM d’inhibiteur de ROCK et les centrifuger à 300 x g pendant 5 min. Retirer le surnageant et compter les cellules dans 10 ml de milieu sans sérum complété par 10 μM d’inhibiteur de ROCK.
3. En parallèle, rincez la plaque du micropuits avec 2 mL de milieu sans sérum par puits et centrifugez la plaque à 1200 x g pendant 5 min pour éliminer toutes les bulles, ce qui peut empêcher la formation de la neurosphère.
4. Préparez 28,2 x 10⁶ cellules dans 12,5 mL de milieu sans sérum complété par un inhibiteur de ROCK 10 μM. Distribution de 1000 cellules/micropuits. Centrifugez les cellules à 300 x g pendant 5 min et placez la plaque dans l’incubateur à 37 °C pendant la nuit (maximum 36 h). Par exemple, pour obtenir 30 organoïdes neuronaux humains, utilisez un flacon T150 à 70 %-80 % de la confluence (environ 30 millions de cellules).
5. Le lendemain (jour 1), récupérez les sphères (avec un P1000) et placez-les dans une assiette à 6 puits. Dans chaque puits, ajoutez 2 ml de milieu B27 et de milieu DMEM-F12 GlutaMAX et Neurobasal (mélange à 1:1), complété par 1 % de suppléments de B27 et 1 % d’acides aminés non essentiels (NEAA). Pour favoriser une induction neuronale rapide, complétez le milieu avec un cocktail d’inhibition dual-SMAD (Sma and Mad Related Protein) composé de 10 μM de TGFβ (Transforming Growth Factor-beta)/inhibiteur d’activine/ganglionnaire et de 0,5 μM d’inhibiteur de protéine morphogénique osseuse (BMP). A partir de ce pas, les sphères sont cultivées en rotation (60 tr/min, agitateur orbital). La rotation est essentielle pour éviter que les sphères ne se collent ensemble ou à la plaque.
6. Changez de milieu tous les 2-3 jours : pliez l’assiette et laissez tomber les sphères pendant 5 min, retirez la moitié du milieu (2 ml) et ajoutez 2 ml de milieu B27 frais complété par des facteurs de croissance et des inhibiteurs. Ne centrifugez pas les sphères.
7. Effectuez l’induction neuronale selon le déroulement temporel suivant :
   1. Du 1er au 4e jour, cultiver les sphères dans un milieu B27 complété par un double SMAD. Le cocktail d’inhibition dual-SMAD (10 μM TGFβ/Activine/inhibiteur ganglionnaire et 0,5 μM inhibiteur de BMP) favorise l’induction neuronale.
   2. Du 4e au 11e jour, favoriser la prolifération des rosettes neurales dérivées de CSEh (dans les sphères), en ajoutant 10 ng/mL de facteur de croissance épidermique (EGF) et 10 ng/mL de facteur de fibroblaste basique (bFGF) au milieu B27 complété par un cocktail dual-SMAD.
      note: Au 11e jour, la plupart des cellules devraient être positives pour Nestin.
   3. Du 11e au 13e jour, cultiver les sphères dans un milieu B27 complété par un inhibiteur de BMP de 0,5 μM.
   4. Du 13e au 21e jour, cultiver les sphères dans un milieu B27 complété par 10 ng/mL de facteur neurotrophique dérivé de la glie (GDNF), 10 ng/mL de facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) et 1 μM d’inhibiteur de la γ-sécrétase. Le GDNF et le BDNF favorisent la différenciation neuronale et gliale. L’inhibiteur de la γ-sécrétase permet une plus grande maturation neurale.
   5. Le jour 21, plaquez les sphères (environ 1 000 sphères) sur une membrane hydrophile en polytétrafluoroéthylène (PTFE) (6 mm de diamètre, 0,4 μm) déposée sur un insert de plaque de culture conçu pour des plaques à 6 puits. Arrêtez toute rotation à partir de cette étape. La présence de rosettes, observées au microscope à fond clair, indique l’initiation de la différenciation neuronale. Les rosettes neurales peuvent être observées 2-3 jours après le placage des sphères sur la membrane PTFE.
   6. Ajouter 1 ml de milieu B27 complété par des facteurs de croissance et des inhibiteurs (comme suit) dans chaque puits sous l’insert membranaire, tous les 2-3 jours (généralement le lundi, le mercredi et le vendredi), pendant les 3 semaines suivantes de différenciation.
   7. Du 21e au 25e jour, cultivez des organoïdes neuronaux humains dans le même milieu de maturation neuronale.
   8. Du 25e au 28e jour, compléter uniquement le milieu B27 avec 1 μM d’inhibiteur de la γ-sécrétase.
   9. Du 28 au 39e jour, arrêtez d’ajouter l’inhibiteur de la γ-sécrétase et continuez la culture d’organoïdes neuraux humains dans le milieu B27 uniquement.
      note: Après 3 semaines, les organoïdes neuraux sont prêts à être utilisés pour l’implantation du GIC. Au cours de la maturation neurale, une diminution du marqueur neural immature Nestin et une augmentation des marqueurs neuronaux matures β3-tubuline et GFAP ont été observées.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque à 6 puits (plaque à 6 puits)	Faucon / Corning	Tél. : 07-201-588
Aggrewell 400 (Plaques de culture de micropuits)	Technologies StemCell	Référence 34421
Suppléments de B27 (B27)	Technologies de la vie / Invitrogen	1238	Pour les deux protocoles, solution mère 100x, solution finale 1x
Facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF)	Guidage des cellules	GFH1-2	Pour les deux protocoles, solution mère 100 μg/mL dans de l’H2O pur, solution finale 20 ng/mL
Composé E : un inhibiteur de la γ-sécrétase (inhibiteur de la γ-sécrétase)	Calbiochimie	NCA 209986-17-4	Pour les deux protocoles (inhibiteur de la gamma-sécrétase XXI), solution mère 5 mM dans DMSO, solution finale 1 μM
Diméthylsulfoxyde pur (DMSO)	Sigma-Aldrich	Réf. C6164	Composés solvants, prêts à l’emploi
Milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM)	Technologies de la vie	Référence 12491-015	Pour la culture cellulaire, prêt à l’emploi
Mélange moyen Eagle modifié de Dulbecco F-12 (DMEM-F12)	Gibco	11320033	Pour la culture cellulaire, prêt à l’emploi
EDTA 0,1 mM (EDTA)	Technologies de la vie	Référence AM9912	Pour la culture cellulaire, prêt à l’emploi
Facteur neurotrophique dérivé des cellules gliales (GDNF)	Guidage des cellules	GFH2-2	Pour les deux protocoles, solution mère 100 μg/mL dans de l’H2O pur, solution finale 20 ng/mL
Membrane hydrophile en polytétrafluoroéthylène (membrane PTFE)	Interface BioCell	Abandonné
LDN-193189 (inhibiteur de BMP)	Axon Medchem /Stemgen	Référence 04-0072-02 /1509	Dual/Smad, solution mère 5 mM dans DMSO, solution finale 0,5 μM
L-glutamine (L-glutamine)	Gibco	25030081	L-Glutamine (200 mM), solution mère 200 mM, solution finale 2 mM
Matrigel (matrice extracellulaire)	BD Biosciences	354277	Matrice qualifiée ESCh, solution mère 18-22 mg/mL, solution finale 180-220 μg/mL
Insert de plaque de culture Millicell-CM (0,4 μm) (insert de plaque de culture)	Millipore	PICM03050
Anticorps monoclonal anti-β-tubuline III	sigma	Réf. T8660	Dilution de 1/1000
Agitateur orbital MS, MS-NOR-30 (Agitateur orbital)	Majeure scientifique	MS-NRC-30
Neurobasal (Neurobasal)	Technologies du Vivant / Gibco	21103049	Maintien et maturation des populations de cellules neuronales embryonnaires, prêtes à l’emploi
Acides aminés non essentiels (NEAA)	Gibco	Référence 11140	Acides aminés non essentiels 100X, solution mère 100x, solution finale 1x
Anticorps Nurr1 (M-196)	Santa Cruz	SC-5568	Dilution de 1/100
Nutristem (milieu hESC )	Industries biologiques	Référence 05-100-1A	Milieux de cellules souches, prêts à l’emploi
Pénicilline / Streptomycine (Pénicilline / Streptomycine )	Technologies du Vivant / Gibco	15140122	Pour la culture cellulaire, solution mère 5 mg/mL, solution finale 50 μg/mL
Saline tamponnée au phosphate sans Ca2+/Mg2+ (PBS sans Ca2+/Mg2+ )	Technologies de la vie	14190250	Pour la culture cellulaire, prêt à l’emploi
Kinase associée à Rho Y-27632 (ROCK)	Abcam Biochimiques	AB120129-1	Inhibiteur de roche, solution mère 50 mM dans du DMSO, solution finale 10 μM
SB-431542 (TGFβ/Activine/Inhibiteur nodal)	ascension	Asc- 163	Dual-Smad, solution mère 50 mM dans DMSO, solution finale 10 μM
StemPro Accutase (solution enzymatique hESC)	Gibco	Référence A11105-01	Solution enzymatique hESC, prête à l’emploi
Fiole T150 (fiole T150)	Faucon	Référence 08-772-1F
Facteurs de croissance transformants bêta 3 (TGFβ3)	Guidage des cellules	GFH109-2	Pour le protocole dopaminergique, solution mère 100 μg/mL dans de l’éthanol pur, solution finale 1 ng/mL
Trypsine 0,25 % (solution enzymatique)	Technologies de la vie	15050065	Solution enzymatique, prête à l’emploi
X-vivo (milieu sans sérum)	Lonza	BE04-743Q	Medium sans sérum, prêt à vous