Génération d’organoïdes neuronaux dopaminergiques à partir de cellules souches embryonnaires humaines

Résumé

Source : Cosset, E. et al. Organoïdes neuronaux humains pour l’étude du cancer du cerveau et des maladies neurodégénératives. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo démontre la différenciation des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) en neurones dopaminergiques, afin de fournir un modèle pour l'étude de la maladie de Parkinson. Les CSEh sont cultivées dans un milieu d’induction neuronale dans une plaque de micropuits pour former des neurosphères 3D. Ceux-ci sont ensuite cultivés dans un milieu d’induction neuronale pour favoriser la différenciation en neurones progéniteurs dopaminergiques. La maturation finale des neurones se produit dans un insert de culture dans des conditions d’interface air-liquide, ce qui donne des organoïdes 3D constitués de neurones dopaminergiques matures.

Protocole

1. Organoïdes dopaminergiques dérivés de CSEh pour les études sur la maladie de Parkinson (MP)

1. Jour 0 : Amplifier les CSEh en culture 2D jusqu’à 60 % de confluence (jour 0), puis remplacer les milieux de cellules souches utilisés pour maintenir les caractéristiques de pluripotence des CSEh par un milieu sans sérum. Commencer l’induction neurale en complétant le milieu de culture avec un inhibiteur de la protéine morphogénétique osseuse (BMP) de 0,5 μM et un inhibiteur du facteur de croissance transformant bêta (TGFβ)/Activine/Nodal de 10 μM (cocktail d’inhibition dual-SMAD), puis ajouter 10 μM d’inhibiteur de protéine kinase associée à Rho (ROCK) pendant 24 h pour augmenter le taux de survie des cellules pendant le passage.
2. Jour 1 : Préparez la plaque de micropuits avec 2,5 ml par puits de milieu sans sérum complété par un inhibiteur de BMP de 0,5 μM, un inhibiteur de TGFβ/d’Activine/ganglionnaire de 10 μM et un inhibiteur de ROCK de 10 μM. Pour spécifier les cellules vers le motif ventral du tube neural, ajoutez 100 ng/mL de Sonic Hedgehog (SHH), 100 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes 8 (FGF8) et 2 μM d’agoniste lissé. Centrifuger la plaque (uniquement avec milieu et sans cellules) à 1200 x g pendant 5 min pour éliminer les bulles d’air des micropuits.
   1. Après 1 jour d’induction neuronale en 2D, retirer le milieu et laver rapidement avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans Ca²⁺/MgCl²⁺. Dissocier les colonies en suspension unicellulaire en ajoutant 7,5 mL de solution enzymatique recombinante dans une fiole T75 cm². Incuber pendant 2 minutes à 37 °C, puis compléter avec 7,5 mL de milieu et de mélange nutritif Eagle modifié F-12 de Dulbecco (DMEM-F12).
   2. Recueillir la suspension cellulaire et centrifuger à 300 x g pendant 5 min. Retirer le surnageant et compter les cellules dans le même milieu que celui utilisé pour préparer la plaque de micropuits.
   3. Ajuster le volume moyen pour obtenir une suspension cellulaire permettant de former des neurosphères contenant 1000 cellules par micropuits (par exemple, la plaque de micropuits utilisée ici contient 4 700 micropuits par puits). Préparez donc 4,7 millions de cellules dans 2,5 ml de milieu et ajoutez-les aux 2,5 ml de milieu déjà placés dans la plaque.
   4. Pour répartir correctement les cellules dans chaque micropuits, secouez doucement la plaque et centrifugez la plaque du micropuits 300 x g pendant 5 min. Incuber la plaque à 37 °C pendant 24 h pour générer des sphères.
3. Jour 2 : Rincez doucement les micropuits avec le milieu et récupérez puis transférez les sphères dans une plaque à six puits traitée pour les tissus. Remplacez le milieu par un milieu neurobasal complété par 1 % de B27, 1 acide aminé non essentiel (NEAA), 2 mM de L-glutamine et 1 % de pénicilline/streptomycine. De plus, ajoutez les facteurs de régionalisation SHH, FGF8, agoniste lissé et les petites molécules d’inhibition dual-SMAD.
   1. Placez les sphères en rotation à 37 °C (60 tr/min, agitateur orbital) et changez les demi-moyens fraîchement complétés tous les 2-3 jours.
4. Jour 3 : Pour améliorer l’induction neuronale et se convertir en progéniteurs neuronaux avec une identité mésencéphale, complétez le milieu avec un inhibiteur de la glycogène synthase kinase-3 bêta (GSK-3β), qui active la voie Wnt/β-caténine. Maintenir l’inhibiteur de GSK-3β dans le milieu jusqu’au jour 13. Divisez-vous en deux nouvelles plaques à 6 puits traitées pour réduire à la fois la densité des sphères par puits et éviter l’agrégation des sphères.
   note: Au jour 8, la plupart des cellules devraient être positives pour Nestin.
5. Jour 8 : Début de la maturation neurale : remplacement des facteurs de régionalisation SHH, FGF8, agoniste lissé et cocktail d’inhibition dual-SMAD par 0,5 mM d’adénosine monophosphate cyclique dibutyryl (AMPc) (pour favoriser la maturation), inhibiteur de 20 nM de l’histone désacétylase (pour la sortie du cycle cellulaire), inhibiteur de la γ-sécrétase 1 μM et facteurs de croissance, 10 ng/mL de facteur neurotrophique dérivé de la lignée cellulaire gliale (GDNF), 10 ng/mL de facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF), 1 ng/mL de facteur de croissance transformant β3 (TGFβ3) et 5 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes 20 (FGF20) (tous deux favorisent la survie des progéniteurs dopaminergiques [DA]). Changez de milieu tous les 2-3 jours.
6. Jour 21 : Génération de l’organoïde neural : ensemencement d’environ 100 neurosphères dans des conditions d’interface air-liquide sur du polytétrafluoroéthylène (membrane PTFE, 6 mm de diamètre). Transférez la membrane dans une plaque de culture (0,4 mm) et ajoutez 1,2 mL de milieu de maturation neurale utilisé pour la différenciation de la neurosphère comme décrit précédemment.
   1. Arrêtez toute rotation à partir de cette étape. Changez de milieu tous les 2-3 jours jusqu’à ce que le point de différenciation requis soit atteint.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque à 6 puits (plaque à 6 puits)	Faucon / Corning	Tél. : 07-201-588
Aggrewell 400 (Plaques de culture de micropuits)	Technologies StemCell	Référence 34421
Suppléments de B27 (B27)	Technologies de la vie / Invitrogen	1238	Pour les deux protocoles, solution mère 100x, solution finale 1x
Facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF)	Guidage des cellules	GFH1-2	Pour les deux protocoles, solution mère 100 μg/mL dans de l’H2O pur, solution finale 20 ng/mL
CHIR-99021 (inhibiteur de GSK-3β)	Axon Medchem	Réf. CT99021	Pour le protocole dopaminergique, solution mère 7,5 mM dans DMSO, solution finale 3 μM
Composé E : un inhibiteur de la γ-sécrétase (inhibiteur de la γ-sécrétase)	Calbiochimie	NCA 209986-17-4	Pour les deux protocoles (inhibiteur de la gamma-sécrétase XXI), solution mère 5 mM dans DMSO, solution finale 1 μM
Dibutyryl cyclique-AMP (dibutyryl cAMP)	sigma	D0627	Pour le protocole dopaminergique, solution mère 0,5 M dans le DMSO, solution finale 0,5 mM
Mélange moyen Eagle modifié de Dulbecco F-12 (DMEM-F12)	Gibco	11320033	Pour la culture cellulaire, prêt à l’emploi
EDTA 0,1 mM (EDTA)	Technologies de la vie	Référence AM9912	Pour la culture cellulaire, prêt à l’emploi
Facteur de croissance des fibroblastes 20 (FGF20)	Peprotech	100 à 41	Pour le protocole dopaminergique, solution mère 100 μg/mL dans de l’H2O pur, solution finale 5 ng/mL
facteur de croissance des fibroblastes 8 (FGF8)	Peprotech	GFH176-5	Pour le protocole dopaminergique, solution mère 100 μg/mL dans de l’H2O pur, solution finale 100 ng/mL
Facteur neurotrophique dérivé des cellules gliales (GDNF)	Guidage des cellules	GFH2-2	Pour les deux protocoles, solution mère 100 μg/mL dans de l’H2O pur, solution finale 20 ng/mL
Membrane hydrophile en polytétrafluoroéthylène (membrane PTFE)	Interface BioCell	Abandonné
LDN-193189 (inhibiteur de BMP)	Axon Medchem /Stemgen	Référence 04-0072-02 /1509	Dual/Smad, solution mère 5 mM dans DMSO, solution finale 0,5 μM
L-glutamine (L-glutamine)	Gibco	25030081	L-Glutamine (200 mM), solution mère 200 mM, solution finale 2 mM
Insert de plaque de culture Millicell-CM (0,4 μm) (insert de plaque de culture)	Millipore	PICM03050
Agitateur orbital MS, MS-NOR-30 (Agitateur orbital)	Majeure scientifique	MS-NRC-30
Suppléments de N2 (N2)	Invitrogen	Référence 17502-048	Pour la culture GIC, solution mère 100x, solution finale 1x
Neurobasal (Neurobasal)	Technologies du Vivant / Gibco	21103049	Maintien et maturation des populations de cellules neuronales embryonnaires, prêtes à l’emploi
Acides aminés non essentiels (NEAA)	Gibco	Référence 11140	Acides aminés non essentiels 100X, solution mère 100x, solution finale 1x
Nutristem (milieu hESC )	Industries biologiques	Référence 05-100-1A	Milieux de cellules souches, prêts à l’emploi
Pénicilline / Streptomycine (Pénicilline / Streptomycine )	Technologies du Vivant / Gibco	15140122	Pour la culture cellulaire, solution mère 5 mg/mL, solution finale 50 μg/mL
Saline tamponnée au phosphate sans Ca2+/Mg2+ (PBS sans Ca2+/ Mg2+ )	Technologies de la vie	14190250	Pour la culture cellulaire, prêt à l’emploi
Purmorphamine (agoniste lissé)	Calbiochimie	SML0868	Pour le protocole dopaminergique, solution mère 10 mM dans DMSO, solution finale 2 μM
Kinase associée à Rho Y-27632 (ROCK)	Abcam Biochimiques	AB120129-1	Inhibiteur de roche, solution mère 50 mM dans du DMSO, solution finale 10 μM
SB-431542 (TGFβ/Activine/Inhibiteur nodal)	ascension	Asc- 163	Dual-Smad, solution mère 50 mM dans DMSO, solution finale 10 μM
Hérisson sonique (SHH)	Guidage des cellules	GFH168-5	Pour le protocole dopaminergique, solution mère 100 μg/mL dans de l’H2O pur, solution finale 100 ng/mL
StemPro Accutase (solution enzymatique hESC)	Gibco	Référence A11105-01	Solution enzymatique hESC, prête à l’emploi
Fiole T150 (fiole T150)	Faucon	Référence 08-772-1F
Facteurs de croissance transformants bêta 3 (TGFβ3)	Guidage des cellules	GFH109-2	Pour le protocole dopaminergique, solution mère 100 μg/mL dans de l’éthanol pur, solution finale 1 ng/mL
Trichostatine A (inhibiteur de l’histone désacétylase)	sigma	Réf. T8552	Pour le protocole dopaminergique, solution mère 100 μM dans DMSO, solution finale 20 nM
TrypLE (solution enzymatique recombinante)	Invitrogen	12604021	solution enzymatique recombinante, prête à l’emploi
Trypsine 0,25 % (solution enzymatique)	Technologies de la vie	15050065	Solution enzymatique, prête à l’emploi
X-vivo (milieu sans sérum)	Lonza	BE04-743Q	Milieu sans sérum, prêt à l’emploi