REMARQUE : Les lignées transgéniques utilisées dans cette étude comprennent la lignée spécifique aux macrophages mpeg1 :mCherry (construite en interne), la mpo spécifique aux neutrophiles : GFP, gata1 :dsRed spécifique aux érythroïdes et ubiq :secAnnexinV-mVenus, un rapporteur de la mort cellulaire (re-dérivé en maison) sur des arrière-plans de type sauvage, de nacre (mitfaw2/w2) et de mutant (bbhm292).
1. Jour 0 : Production et collecte des œufs
- Collectez des embryons fécondés à partir de pontes naturelles dans des boîtes d’élevage produites à partir de 1 poisson zèbre mâle et 1-2 femelle poisson-zèbre adulte.
note: Pour le protocole atorvastatine, tous les animaux de type sauvage/transgénique peuvent être utilisés ; Cependant, les taux d’hémorragie diffèrent légèrement entre les souches.
- Incuber 100 embryons à 28 °C dans un milieu embryonnaire standard E3 par boîte de Pétri et à la stades selon les directives standard.
- À ~6 heures après la fécondation (hpf), retirez les embryons morts et non fécondés de la boîte à l’aide d’une pipette Pasteur. La figure 1 montre la chronologie de l’expérience.
2. Jour 1 : Traitement à l’atorvastatine à 24 hpf
- Embryons déchorionnés pour le traitement à l’atorvastatine à l’aide d’une pince de dissection pointue et ultra-mince. Le nombre requis pour l’expérimentation peut être ajusté en conséquence.
- Ajouter 30 ml de milieu d’embryon E3 dans deux boîtes de Pétri propres. Utilisez une boîte pour 100 embryons.
note: Si les plaques sont conçues pour la culture cellulaire, les poissons-zèbres déchoionnés à ce stade précoce collent souvent au fond. Pour éviter cela, rincez abondamment les plaques à l’eau claire avant utilisation.
- Retirer 60 μL d’eau embryonnaire de la plaque de traitement et ajouter 60 μL d’atorvastatine (ATV) à 0,5 mM. À une concentration de stock de 0,5 mM, la dilution ci-dessus donnera une concentration finale de 1 μM, ce qui se traduira par ~20 % de larves non hémorragiques (ICH-) et ~80 % de larves hémorragiques (ICH+). Utilisez l’autre plaque pour les témoins non traités.
note: L’atorvastatine est solubilisée dans de l’eau distillée (3 mg dans 10 mL) pour former une solution mère de 0,5 mM. Incuber toute la nuit à température ambiante dans l’obscurité avec agitation car la solubilisation prend un certain temps. La solubilisation complète peut prendre jusqu’à 1 semaine. N’utilisez pas de DMSO (Diméthylsulfoxyde). La solution est aliquote et stockée à -20°C. Ne pas geler-décongeler.
- À l’aide d’une pipette Pasteur, transférez 100 embryons dans le moins d’eau possible sur les plaques de traitement.
- Incuber les plaques à 28 °C
note: L’ICH (hémorragie intracérébrale) se produira entre 33 et 48 hpf. Il n’est pas nécessaire d’éliminer l’atorvastatine, car une incubation de plus de 24 h ne cause pas d’autres problèmes de développement.
3. Jour 2 : Séparation des populations ICH- et ICH+ à 50 hpf
- Séparez les poissons ICH+ des populations ICH- et transférez-les dans de nouveaux plats pour plus de facilité.
- Si l’on utilise le modèle ATV à une concentration de 1 μM, 75 à 100 % des larves présenteront une hémorragie (ICH+) à ce moment-là.
note: La réponse des larves diffère entre les souches, si les larves n’hémorragient pas aux fréquences souhaitées, utilisez un lot frais d’atorvastatine ou une concentration plus élevée. Si les larves n’ont pas présenté d’hémorragie de 48 hpf, considérez-les comme ICH-.
- Si l’on utilise le modèle bbah, tous les mutants homozygotes présenteront une hémorragie de 48 hpf. Si vous utilisez un croisement hétérozygote, les frères et sœurs hétérozygotes et de type sauvage peuvent être utilisés comme animaux témoins pour les expériences.
- Si nécessaire, anesthésier les larves en ajoutant 0,02 % de MS222 au milieu E3. À l’aide d’une pipette Pasteur, trier les larves pour détecter la présence de sang dans la tête dans un milieu E3 frais. Voir Figure 2.
note: Le sang dans la tête peut apparaître dans le cerveau avant, moyen ou postérieur ou en combinaison, et le volume de saignement peut varier d’un animal à l’autre. Chez les mutants bbah, l’ICH est souvent associée à un œdème sévère, qui est reconnaissable à des têtes plus grandes, à un espace plus large entre les yeux et à un saignement plus diffus. Cependant, toutes les larves d’ICH+ bbh ne présentent pas d’œdème.
