Coloration immunofluorescente de sialoglycoprotéines dans des cellules et des neurones progéniteurs neuraux

Résumé

Source : Bai, Q., et al., Identification des marqueurs de surface cellulaire des cellules souches neurales primaires et des cellules progénitrices par marquage métabolique du sialoglycane. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo démontre la biotinylation et le marquage fluorescent des sialoglycoprotéines modifiées dans les cellules souches neurales primaires et les cellules progénitrices, ainsi que dans les neurones, et leur visualisation à l’aide de la microscopie à fluorescence.

Protocole

1. Coloration immunofluorescente des sialoglycoprotéines dans les NSPC primaires élargies et les neurones différenciés

1. Préparez le complexe BTTAA-CuSO₄ 1 30x stock contenant 1,5 mM CuSO₄ et 9 mM BTTAA dans de l’eau doublement distillée. Préparez un tampon 1 fraîchement conjugué à la biotine contenant 50 μM de biotine-alcyne, 2,5 mM d’ascorbate de sodium et 1x complexe BTTAAA-CuSO₄ dans du PBS.
2. Retirez les inserts des plaques de coculture. Aspirez le milieu de culture à partir des puits inférieurs et lavez les cellules neurales une fois avec du PBS préchauffé.
3. Aspirer le PBS des puits. Ajouter 1 mL de solution de PBS de paraformaldéhyde à 4 % pré-refroidie par puits dans les cellules et les fixer à RT pendant 10 min. Ensuite, lavez les cellules 3 fois avec du PBS pré-réfrigéré.
4. Aspirez le PBS des puits et ajoutez 1 mL de tampon conjugué à la biotine fraîchement préparé, 1 par puits, dans les cellules. Incuber les cellules à RT pendant 10 min.
5. Aspirez le tampon de réaction des puits. Lavez les cellules 3 fois avec du PBS. Préparez le tampon de coloration contenant 1 % de FBS et 1 μg/mL d’Alexa Fluor 647-streptavidine. Ajouter 1 mL de tampon de coloration par puits dans les cellules et incuber les cellules à RT pendant 30 min.
6. Aspirez le tampon de coloration des puits et lavez les cellules 3 fois avec du PBS pré-réfrigéré. Préparez le tampon de blocage contenant 5 % de BSA et 0,3 % de détergent non ionique-100 dans du PBS. Ajouter 1 mL de tampon de blocage par puits dans les cellules et incuber à RT pendant 10 min.
7. Préparez une solution primaire d’anticorps en diluant les anticorps anti-nestine et anti-β-tubuline III dans le tampon bloquant à des ratios de 1:20 et 1:1 000, respectivement. Retirer le tampon de blocage des puits et ajouter 1 mL de solution d’anticorps primaires par puits dans les cellules. Incuber les cellules à 4 °C pendant la nuit.
8. Retirez la solution d’anticorps primaire des puits. Lavez les cellules 3 fois avec du PBS pré-réfrigéré. Préparez une solution d’anticorps secondaires en diluant Alexa Fluor 488 IgG1 pour chèvre anti-souris, Alexa Fluor 546 chèvre anti-souris IgG2b et DAPI ensemble dans un tampon bloquant à une dilution de 1:1 000. Aspirez le PBS des puits et ajoutez 1 mL de solution d’anticorps secondaires par puits dans les cellules. Incuber les cellules à RT pendant 2 h.
9. Aspirez la solution d’anticorps des puits et lavez les cellules 3 fois avec du PBS pré-refroidi. Ensuite, les cellules sont prêtes pour la capture d’image.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Sérum fœtal bovin	Gibco	10099141	10 %
paraformaldéhyde	sigma	158127	4 %
DAPI	Gibco	Référence 62248
Plaque à 6 puits	Corning	Référence 3335
Anti-Nestin monoclonal de souris	Etude développementale Hybridoma Bank	Rat-401	1 à 20
Souris monoclonale anti-bêta-tubuline III	sigma	Réf. T8860	1 à 1000
Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgG1	Invitrogen	A-21121	1 à 1000
Alexa Fluor 546 chèvre anti-souris IgG2b	Invitrogen	A-21143	1 à 1000
Triton X-100	Amresco	694
Sulfate de cuivre	sigma	209198
Alcyne-biotine	Cliquez sur Outils de chimie	TA105
BTTAA	Cliquez sur Outils de chimie	N° 1236
ascorbate de sodium	sigma	A4034
Alexa Flour 647-streptavidine conjuguée	Invitrogen	Réf. S21374	1 à 1000