Évaluation in vitro de l’β amyloïde agrégée sur l’effondrement du cône de croissance neuronale

Résumé

Source : Kuboyama, T. Visualisation de l’effondrement du cône de croissance axonale et des effets précoces de la β amyloïde dans les neurones de souris en culture. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo montre une évaluation in vitro de l’effondrement du cône de croissance neuronale par des agrégats de β amyloïde (Aβ). Le traitement des neurones avec des agrégats Aβ provoque une déstabilisation du cytosquelette, entraînant l’effondrement des cônes de croissance à l’extrémité des axones. Les cellules traitées sont comparées à des cellules témoins pour évaluer l’étendue de l’effondrement du cône de croissance.

Protocole

1. Essai d’effondrement

1. poly-D-lysine coating
   1. Enduire les lames de culture à 8 puits de 400 μL de poly-D-lysine (PDL) de 5 μg/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et les incuber à 37 °C pendant la nuit.
   2. Retirez la solution PDL et lavez les puits 3 fois avec de l’eau distillée.
2. Culture de neurones
   1. Hachez des souris embryonnaires du jour 14 (E14) jjY (Deutschland, Denken et Yoken) fraîchement isolées avec des microciseaux dans un milieu de culture neuronale contenant 12 % de sérum de cheval, 0,6 % de glucose et 2 mM de L-glutamine (milieu A). N’ajoutez pas d’antibiotiques.
      note: Dans ce protocole, la souris ddY est utilisée. Il s’agit d’une variété consanguine couramment utilisée au Japon. Ce protocole de culture de neurones peut également être appliqué aux neurones corticaux du rat.
   2. Centrifuger les mouchoirs à 87 x g pendant 3 min.
   3. Retirez le surnageant. Ajouter ensuite à la pastille 2 mL de trypsine à 0,05 % et incuber pendant 15 min à 37 °C. Mélanger en tapotant toutes les 5 min.
   4. Ajouter 4 mL de milieu A et mélanger en tapotant.
   5. Centrifuger les mouchoirs à 178 x g pendant 3 min.
   6. Retirer le surnageant et incuber les tissus avec 600 U/mL de désoxyribonucléase I (DNase I) et 0,3 mg/mL d’inhibiteur de la trypsine de soja dissous dans du PBS pendant 15 min à 37 °C. Mélanger en tapotant toutes les 5 min.
   7. Après l’incubation, ajouter 4 mL de milieu A et mélanger en tapotant.
   8. Centrifuger les mouchoirs à 178 x g pendant 3 min.
   9. Après avoir retiré le surnageant, ajoutez 4 mL de milieu A et triturez les tissus à l’aide d’une pipette Pasteur polie.
   10. Filtrez les tissus triturés à l’aide d’un maillage de la taille d’un pore de 70 μm. Après filtration, calculez la densité des cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
   11. Cultivez les cellules dans la lame de culture à 8 puits à 0,8 x 10⁴ cellules/puits avec le milieu A et maintenez-les dans un incubateur de CO₂ avec une atmosphère humidifiée de 10 % de CO₂ à 37 °C.
   12. Après 4 h de culture, remplacer le milieu de culture par un autre contenant 2 % de supplément pour la culture neuronale, 0,6 % de glucose et 2 mM de L-Glutamine (milieu B).
       note: La pureté des neurones était d’environ 75 %, comme décrit précédemment.
3. Essai de collapsage
   1. Dissoudre l’amyloïde β1-42 (Aβ1-42) obtenue commercialement dans de l’eau distillée à une concentration de 0,5 mM et incuber à 37 °C pendant 7 jours. Après l’incubation, conserver la solution agrégée d’Aβ1-42 dans un congélateur à -30 °C jusqu’à utilisation.
      note: Cette incubation est nécessaire à l’agrégation et à la toxicité de Aβ.
   2. Après 4 jours de culture neuronale, traiter les puits avec 100 μL de nouveau milieu B, contenant 0,5 μM d’Aβ1-42 agrégé ou une solution de véhicule (eau distillée) pendant 1 h.
      note: Les effets de Aβ1-42 ont été augmentés en fonction de la dose, passant de 0,1 à 5 μM, et ont culminé à 0,5 μM, comme décrit précédemment. Des résultats similaires peuvent être observés par un traitement Aβ1-42 pendant 1 h après 3 jours de culture neuronale.
   3. Retirer le milieu de culture et fixer immédiatement les neurones avec 4 % de paraformaldéhyde contenant 4 % de saccharose dans du PBS pendant 1 h à 37 °C sur une plaque chauffante.
   4. Après la fixation, lavez les neurones 3 fois avec du PBS et montez-les avec un milieu de montage aqueux. Faites sécher le produit de montage à 4 °C pendant 2 à 4 jours.
   5. Capturez toute la zone (7,8 x 9 mm²) de chaque puits avec un objectif sec 20X sur un microscope inversé.
   6. Classez les neurites les plus longs de chaque neurone au stade 3 ou 4 comme des axones, comme décrit précédemment.
   7. Classez les cônes de croissance selon les critères suivants : 1) les cônes de croissance axonale dépourvus de lamellipodes ou 2) possédant moins de trois filopodes sont considérés comme des cônes de croissance effondrés, comme décrit précédemment.
      note: Les cônes de croissance sains sont notés à 0 point ; Les cônes de croissance effondrés sont notés à 1 point. Les scores moyens de collapsus sont calculés pour chaque traitement.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
souris ddY	Slc
Lame de culture à huit puits	Faucon	354108
poly D lysine	Wako	Référence 168-19041
Milieu de culture, Milieu neurobasal	Gibco	Référence 21103-049
sérum maison	Gibco	Référence 26050-088
glucose	Wako	Référence 049-31165
L-glutamine	Wako	Référence 074-00522
0,05 % de trypsine	Gibco	Référence 25300-054
DNase I	Worthington	Dp
inhibiteur de la trypsine de soja	Gibco	Référence 17075-029
Filtre avec maille de 70 μm, crépine de cellules	Faucon	Référence 352350
Supplément B-27	Gibco	Référence 17504-044
Incubateur de CO2	Astec	SCA-165DS
Amyloïde β1-42	Sigma-Aldrich	A9810
paraformaldéhyde	Wako	Référence 162 à 16065
saccharose	Wako	Référence 196-00015
Milieu de montage aqueux, AquaPoly/Mount	Polysciences	Référence 18606-20
Microscope inversé A	Carl Zeiss	Axio Observateur Z1	Connecté avec AxioCam MRm, l’unité de chauffage XL S, le module CO2 S1 et le module Temp S1
Objectif Plan-Apochromat 20x	Carl Zeiss	Référence 420650-9901