Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Préparation de coupes de tissus pour la spectrométrie de masse par imagerie (IMS)
- Traitement d’un échantillon de tissu d’un cerveau humain autopsié<br />
note: Assurez-vous que l’étape de préparation de l’échantillon pour l’IMS préserve l’état d’origine du tissu. Évitez la contamination et les modifications post-mortem. L’étape suivante est cruciale.
- Obtenir des échantillons corticaux humains pour l’IMS à partir de cerveaux qui ont été prélevés, traités et stockés à -80 °C dans les 8 heures suivant l’autopsie. Prélever l'échantillon cérébral du cortex occipital de patients atteints de la maladie d'Alzheimer (MA) et de témoins du même âge.
- Préparation de coupes de tissus congelés
- Coupez les sections de tissu sur un cryostat. Placez des lames de microscope conductrices recouvertes d’oxyde d’indium-d’étain (ITO) à l’intérieur du cryostat.
- Réchauffez l’échantillon cérébral d’autopsie de -80 °C à -22 °C à l’intérieur du cryostat.
- Fixez une nouvelle lame jetable au cryostat pour chaque expérience. Essayez toujours d’utiliser une partie propre de la lame.
- Placez les cerveaux d’autopsie congelés sur la scène avec une petite quantité de composé de température de coupe optimale (OCT) (suffisamment pour couvrir la zone centrale de la scène ; voir le tableau des matériaux).
- Choisissez les conditions pour la section mince. Pour l’IMS, utilisez une épaisseur de 10 à 12 μm pour les coupes de cerveau humain. Pour l’IMS et l’immunohistochimie (IHC), coupez cinq à six sections dans chaque échantillon de tissu.
- Lorsque la lame commence tout juste à couper le tissu, tournez la roue et faites face au bloc jusqu’à ce que tout le tissu soit exposé. S’il y a une petite traînée ou une déchirure sur la section, attendez un peu plus longtemps dans le cryostat jusqu’à ce que le réglage de la température la corrige automatiquement. Comptez quelques secondes avant d’ouvrir l’anti-roulis avec un mouchoir en dessous.
- Placez immédiatement la tranche de tissu sur le côté revêtu d’ITO de la lame de verre. Décongelez la tranche de tissu en plaçant un doigt sous la lame du côté non enduit d’ITO. Le tissu collera à la lame ; Assurez-vous que le tissu est aussi plat que possible, sans plis. Effectuez cette étape à température ambiante.
note: Portez des gants, des masques et une blouse de laboratoire, car les échantillons humains peuvent contenir des contaminants biologiques. Lorsque toutes les sections ont été faites pour la journée, nettoyez le cryostat, les brosses et les mandrins avec des lingettes de laboratoire et 200 ml d’éthanol à 100 %.
- Rinçage des sections de tissu
- Immergez les échantillons dans 40 à 100 ml d’éthanol à 70 % pendant 30 s pour éliminer les lipides endogènes et les sels inorganiques. Utilisez un pot de coloration en verre.
- Lavez les échantillons avec 40 à 100 ml d'éthanol à 100 % pendant 30 s, 40 à 100 ml de solution de Carnoy pendant 3 min, 40 à 100 ml d'éthanol à 100 % pendant 30 s, 40 à 100 ml d'acide trifluoroacétique (TFA) à 0,1 % pendant 1 min et 40 à 100 ml d'éthanol à 100 % pendant 30 s. Utilisez un bocal en verre.
note: La solution de Carnoy est un fixateur composé de six parties d'éthanol, de trois parties d'acide acétique et d'une partie de chloroforme.
- Sécher sous vide pendant 30 min.
- Traitement des coupes de tissus avec une vapeur d’acide formique pour une meilleure ionisation des protéines Aβ des tissus cérébraux d’autopsie
- Préparez le four et la lame de verre d’incubation à utiliser pour la vaporisation ultérieure avec 5 ml d’acide formique à 100 %. Pour obtenir un traitement acide satisfaisant, maintenez l’humidité de l’air dans la boîte en verre d’incubation à un niveau de saturation tout au long de cette étape et maintenez la température à 60 °C. Placez les lames de tissu dans la boîte en verre d’incubation en évitant l’immersion dans l’acide formique et traitez pendant 6 min.
- Prenez une image optique des échantillons à l’aide d’un scanner de film, d’un scanner de gel, d’un microscope numérique, etc. Effectuez cette étape à température ambiante. L’alignement de l’image optique des échantillons est nécessaire lorsque la cible de l’échantillon est placée à l’intérieur de l’instrument. Habituellement, il ne sera pas possible de reconnaître la section de tissu sous la couche de matrice.
REMARQUE : Le moyen le plus pratique de prendre une image optique est d’utiliser un scanner de bureau. Il est conseillé d’enregistrer l’image dans le dossier de stockage des données d’imagerie.
- Pour corréler les images optiques avec les échantillons, faites des repères visibles à la fois dans l’image optique et sous la couche matricielle dans l’optique de la caméra. Le moyen le plus simple est de repérer au moins trois marques de liquide de correction autour de l’échantillon avant de prendre l’image optique.
- Application matricielle
- Préparation de la solution matricielle
- Dans un microtube tolérant aux solvants organiques, préparer une solution d’acide sinapinique (SA) à 10 mg/mL dans de l’acétonitrile à 50 % (ACN) et à 0,1 % d’AFT. Dissoudre complètement le composé SA par vortex ou sonication brève pendant 10 min. Conservez la solution à température ambiante jusqu’à utilisation.
REMARQUE : Il existe trois options différentes pour la pulvérisation matricielle : à l’aide d’un aérographe, d’un pulvérisateur à ultrasons ou d’un pulvérisateur automatique.
- Pulvérisation de la matrice à l’aérographe
- Effectuez l’opération à une température ambiante (20-23 °C) et une humidité (40-60 %) constantes. Les paramètres à ajuster pour une pulvérisation optimale comprennent la taille de la gouttelette, la quantité de brouillard, l’angle et la distance entre la buse de pulvérisation et la section de tissu, ainsi que la température et l’humidité du laboratoire. Ajustez ces conditions en vérifiant les résultats de la microscopie.
note: Comme les facteurs limitants comprennent la taille des cristaux et l’homogénéité de la couverture de la matrice et la migration/diffusion indésirable des analytes, plus la taille des gouttes est petite, mieux c’est. L’homogénéité est également le point d’inspection.
- Pulvérisation de la matrice avec un pulvérisateur à ultrasons
- Retirez le tissu à pulvériser du dessiccateur et placez-le dans la chambre. Assurez-vous que le tissu ne recouvre pas la fenêtre du capteur.
- Commencez la préparation en appuyant sur le bouton Start ; généralement, le temps de préparation est d’environ 90 min. La préparation sera régulée automatiquement par le contrôle de l’épaisseur de la couche de matrice et de l’humidité. Une fois la préparation terminée, retirez la lame et rangez-la dans le dessiccateur pendant 15 minutes avant de la lire dans l’instrument MALDI.
- Nettoyez le pulvérisateur avec 2 à 3 ml de méthanol à 100 % (MeOH) jusqu’à ce que la tête de pulvérisation soit propre.
note: Une fine brume de gouttelettes matricielles est laissée s’enfoncer dans le tissu par une nappe gravitationnelle. Une taille moyenne de gouttelettes de 20 μm est générée ; Tous les diamètres de gouttelettes sont inférieurs à 50 μm.
- Pulvérisation de la matrice avec un pulvérisateur automatique
- Vaporisez la solution matricielle à la surface du tissu à l’aide d’un pulvérisateur automatique. Un flux constant de gaz de gaine chauffé (N2, réglé à 10 psi et 75 °C) sera délivré conjointement avec la pulvérisation de solution matricielle. Utilisez un système de pompe à solvant (réglé à 10 psi et 0,15 mL/min) pour administrer la solution matricielle.
note: Plus important encore, travaillez sous une armoire de sécurité pour éviter toute inhalation d’aérosols matriciels. Contrôlez la température et l’humidité de la pièce pour reproduire une cristallisation matricielle homogène.
2. MALDI-IMS
- Effectuer une spectrométrie de masse à ultra-haute vitesse.
- Réalisez des expériences d’imagerie à haut débit et à haute résolution spatiale avec MALDI-IMS équipé d’un laser à grenat d’yttrium et d’aluminium dopé au néodyme de 10 kHz (Nd :YAG, 355 nm).
- Pour les mesures par spectrométrie de masse, définissez les zones tissulaires à l’aide du logiciel de contrôle MALDI et du logiciel d’analyse de données.
- Acquérir des spectres en mode linéaire positif avec une gamme de masse de m/z de 2 000 à 20 000 et une résolution spatiale de 20 et 100 μm.
- Pour réaliser l’étalon d’étalonnage, dissoudre l’étalon peptidique et l’étalon protéique dans un rapport de 1:4 avec l’acide alpha-cyano-4-hydroxyl-cinnamique (CHCA) dans une solution TA30 (ACN : 0,1 % TFA = 30:70), puis diluer 10x. Placez 1 μL d’étalon sur la lame à quatre endroits différents.
- À l’aide d’un logiciel d’histologie moléculaire (voir la Table des matériaux), superposez plusieurs images uniques pour trouver la corrélation spatiale de divers signaux, tels que différents peptides Aβ colocalisant dans les plaques séniles (SP) et les parois artérielles.
