Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Matériaux
- Préparation de l’injection de lipopolysaccharide (LPS)
- Ajouter 25 mL d’eau distillée à 25 mg de poudre de LPS dérivé de Salmonella typhimurium jusqu’à une concentration finale de 1 mg/mL. Conserver l’injection dans un tube stérile à 4 °C
prudence: Le LPS est toxique.
- Préparez une solution de bleu d’Evans (EB) à 2 % dans une solution saline normale à 0,9 % pour maintenir l’injection d’EB à la concentration de travail.
2. Animaux
Administrer du LPS à des rats Sprague-Dawley (SD) mâles, âgés de 10 semaines (poids moyen : 280 ± 20 g) par injection intrapéritonéale.
prudence: Si les rats sont achetés auprès d’une autre organisation, la phase d’adaptation ne doit pas être inférieure à 7 jours.
3. Injections de LPS
- Injectez du LPS par voie intrapéritonéale à chaque rat à une dose de 1 mg/kg et renvoyez les rats dans leur cage d’origine.
note: L’anesthésie n’est pas nécessaire.
- Six heures plus tard, injectez la même dose d’injection de LPS dans les rats.
- Seize heures plus tard, injectez la même dose de LPS chez les rats.
prudence: L’injection de LPS à une dose de 1 mg/kg chez des rats SD peut entraîner un taux de mortalité de 5 %. Le taux de mortalité pourrait encore augmenter chez les rats jeunes ou âgés ou les rates femelles gravides.
- Remettez les rats dans leurs cages après l’injection de LPS et donnez-leur un accès à volonté à la nourriture et aux boissons.
note: Les rats présenteront une réponse inflammatoire systémique distincte, et il est donc essentiel que les cages restent propres tout au long de l’expérience. Les rats doivent surveiller fréquemment (2 fois par jour) leur poids, leur apparence générale et leur attitude après la première injection de LPS. Si les rats commencent à présenter une posture voûtée, une réticence à bouger, une perte de poids significative (>20 %), une coloration à la porphyrine qu’ils doivent être euthanasiés sans cruauté avant le point final de l’étude EB de 7 jours.
4. Collecte d’échantillons
- Injection EB
- Sept jours après la première injection, anesthésiez le rat par voie intrapéritonéale selon le protocole approuvé de l’IACUC.
- Attendez 1 à 2 minutes jusqu’à ce que les rats ne montrent plus de réponses réflexes cornéennes. Effectuez une ponction cardiaque de 5 à 8 mm de profondeur sur chaque rat ; Le point de ponction doit être à 5 mm du bord gauche du sternum au niveau de l’espace intercostal des 3e et 4e rangs.
- Attendre que la récupération sanguine soit observée, puis injecter EB à une dose de 0,2 mL/100 g de poids corporel dans le ventricule cardiaque gauche.
prudence: La ponction cardiaque et l’injection d’EB doivent être effectuées avec soin. L’EB peut être injecté dans la cavité thoracique ou le péricarde au lieu du ventricule cardiaque gauche.
- Aspirez avec un tube vide et remplacez ce volume par un tube EB avant l’injection pour aider à réduire le taux d’échec (par exemple, injection dans la cage thoracique par erreur).
- Gardez le rat en position couchée pendant 10 min.
REMARQUE : Si l’échantillon n’est pas utilisé pour détecter les fuites d’EB dans l’imagerie par immunofluorescence, cette étape peut être omise.
- Observation grossière
- Effectuez des perfusions cardiaques à l’aide d’une solution saline tampon phosphate (PBS) glacée de 1 M pour dégager le système vasculaire cérébral et le cerveau.
- À l’aide d’un scalpel, faites une incision abdominale sur toute la longueur du diaphragme.
- Coupez les côtes juste à gauche de la ligne médiane de la cage thoracique.
- Ouvrez la cavité thoracique. Utilisez des pinces pour exposer le cœur et faciliter le drainage du sang et d’autres liquides.
- Tout en tenant fermement le cœur avec une pince (le cœur doit toujours battre), insérez directement une aiguille dans la saillie du ventricule gauche pour l’étendre à environ 5 mm. Fixez l’aiguille à cette position en la serrant près du point d’entrée.
prudence: N’étendez pas excessivement l’aiguille, car elle peut percer la paroi intérieure et compromettre la circulation des solutions.
- Relâchez la valve pour permettre l’écoulement de la solution PBS glacée (200 à 300 ml) à un rythme lent et régulier d’environ 20 ml/min à l’aide d’une pompe à perfusion. Si les animaux nécessitent une fixation au lieu d’une observation grossière, utilisez la même dose de solution saline glacée à 0,9 %.
- À l’aide de ciseaux bien aiguisés, faites une incision dans l’oreillette, en veillant à ce que la solution s’écoule continuellement. Si le liquide ne s'écoule pas librement ou s'il provient des narines ou de la bouche de l'animal, repositionnez l'aiguille.
- Dépister les MCH par observation brute.
note: Si l’échantillon n’est pas utilisé dans le calcul du nombre de MCH par observation brute, cette étape peut être omise.
- fixation
- Effectuez des perfusions cardiaques à l’aide d’une solution saline glacée à 0,9 % (200 à 300 ml) pour dégager le système vasculaire cérébral et le cerveau.
- Effectuez des perfusions cardiaques en utilisant du paraformaldéhyde glacé à 4 % pour la fixation.
- Décapitez le rat, isolez le cerveau et immergez-le dans une solution de saccharose à 20 % pendant au moins 6 h.
- Changez la solution en 30 % de saccharose et laissez reposer encore 6 heures.
- Préparez des coupes de tissus cérébraux de 10 mm d’épaisseur à l’aide d’un cryostat.
5. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE)
REMARQUE : Cette procédure est effectuée à l’aide d’un kit de coloration HE.
- Lavez les lames à l’eau distillée.
- Colorer dans une solution d’hématoxyline pendant 8 min. Laver à l’eau courante du robinet pendant 5 min.
- Différencier à l’alcool acide à 1 % pendant 30 s. Laver à l’eau courante du robinet pendant 1 min.
- Colorer dans de l’eau ammoniacale à 0,2 % (Bluing) ou une solution saturée de carbonate de lithium pendant 30 s à 1 min. Laver à l’eau courante du robinet pendant 5 min.
- Rincer à 95 % d’alcool (10 trempettes).
- Contre-coloration avec une solution d’éosine pendant 30 s à 1 min.
- Déshydrater à travers de l’alcool à 95 %, deux changements d’alcool absolu, pendant 5 min chacun.
- Transparent dans du xylène pendant 30 s.
- Montez en utilisant la méthode de Liu.
- Analyser à l’aide d’un microscope à fluorescence à fond clair.
note: Les globules rouges libérés par les vaisseaux sanguins, qui sont les composants des CMH, apparaissent en rouge-orange sous coloration HE.
