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Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Culture cellulaire primaire de l’hippocampe
- Préparez la culture cellulaire dissociée de l’hippocampe du rat au 19e jour embryonnaire. Plaquez les cellules sur des lamelles de recouvrement de 12 mm recouvertes de polyéthylèneimine (PEI) dans des boîtes de 24 puits à une densité de 50 000 à 60 000 cellules/puits. Vérifiez la densité à l’aide d’une chambre de comptage de cellules et d’une optique de contraste de phase.
- Cultiver les neurones pendant 3 jours (jour in vitro (DIV) 3) dans une plaque de 24 puits dans l’incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2.
- Évaluer les lamelles pour détecter les indicateurs de santé cellulaire à l’aide de la microscopie à lumière transmise (p. ex., optique à contraste de phase à un grossissement de 10 à 20X). Vérifiez les indicateurs suivants d’une bonne santé : un halo de contraste de phase clair, des neurites sans structures perlées, et pas de regroupement de soma ou de neurite.
2. Transfection
NOTE : Le protocole suivant fait référence à une double transfection pour 3 puits. Cependant, le protocole fonctionne mieux lorsque des quantités suffisantes pour 4 puits sont préparées.
- Préparez 500 mL de tampon de transfection (274 mM de chlorure de sodium, NaCl, 10 mM de chlorure de potassium, KCl, 1,4 mM d’hydrogénophosphate disodique, Na2HPO4, 15 mM de glucose, 42 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique, HEPES) dans un erlenmeyer.
- Dissoudre 8,0 g de NaCl, 0,37 g de KCl, 0,095 g de Na2HPO4, 1,35 g de glucose et 5,0 g de HEPES dans 400 ml d’eau distillée dans un erlenmeyer.
- Ajustez le pH à 6,95 avec 1 M d’hydroxyde de sodium, NaOH à l’aide d’un pH-mètre.
- Ajustez le volume avec de l’eau distillée à 500 mL et vérifiez le pH à l’aide d’un pH-mètre.
- Effectuer 20 à 30 mL d’aliquotes de tampon de transfection avec les valeurs de pH suivantes en pipetant 1 M de NaOH sur le tampon de transfection : 6,96, 6,97, 6,98, 6,99, 7,00, 7,01, 7,02, 7,03, 7,04, 7,05, 7,06, 7,07, 7,08, 7,09, 7,11.
REMARQUE : Le pH du tampon de transfection est crucial pour l’efficacité de la transfection.
- Pour tester quel tampon de transfection conduit au plus grand nombre de cellules transfectées, testez chaque valeur de pH de 6,96 à 7,11. Utiliser la méthode de transfection décrite aux points 2.2 à 2.11 et un plasmide validé exprimant la protéine fluorescente verte (GFP). Déterminez le nombre de cellules transfectées par lamelle pour chaque valeur de pH du tampon de transfection afin d’évaluer quel tampon fonctionne le mieux.
- Aliquote le tampon avec l’efficacité de transfection la plus élevée dans des tubes de microcentrifugation de 2 mL Congelez et stockez les tubes à -20 °C.
- Préchauffez le milieu sérique réduit, le milieu de culture cellulaire et l’eau distillée à 37 °C dans le bain-marie.
- Préparez le mélange de transfection dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Travailler sous la hotte à flux laminaire pour garantir des conditions de travail stériles.
- Mélangez 7,5 μL de chlorure de calcium 2 M avec 4 μg de chaque ADN exempt d’endotoxines (Synaptophysine-mOrange et mGFP/GFP-Rogdi). Ajouter de l’eau pour atteindre un volume total de 60 μL dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
- Ajoutez 60 μL de tampon de transfection au mélange. Pour obtenir les meilleurs résultats, ajoutez le tampon de transfection goutte à goutte tout en secouant doucement le mélange d’ADN sur le vortex.
- Incuber à température ambiante (RT) pendant 20 minutes. Évitez de secouer le tube d’incubation pendant le temps d’incubation en plaçant le tube à côté de la hotte à flux laminaire.
- Sous la hotte à flux laminaire, retirez le milieu de culture cellulaire (« milieu conditionné ») des puits à l’aide d’une pipette de 1000 μL et stockez-le dans un récipient séparé dans l’incubateur.
- Ajouter 500 μL de sérum réduit dans chaque puits. Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO2 jusqu’à la fin de la période d’incubation de 20 minutes (étape 2.3.3).
- Ajoutez 30 μL de mélange de transfection dans chaque puits en pipetant plusieurs gouttes. Jetez le résidu au fond du tube.
- Une fois que tous les puits ont été alimentés en mélange de transfection, secouez doucement la plaque à 24 puits pour assurer la distribution du mélange de transfection dans le milieu.
- Incuber les puits pendant 60 minutes à 37 °C et 5 % de CO2.
- Retirez et jetez le mélange de transfection et lavez-le trois fois avec un milieu de culture cellulaire. Ajouter 1 mL de milieu de culture cellulaire dans chaque puits et les incuber pendant 30 secondes à RT. Retirer 750 μL de milieu et ajouter la même quantité de milieu frais. Répétez cette opération trois fois.
REMARQUE : L’étape de lavage est critique. Gardez le temps pendant lequel chaque puits n’a pas de milieu au minimum (c’est-à-dire retirer et remplacer puits par puits) et ajoutez doucement le milieu de lavage.
- Retirer et jeter le milieu de culture cellulaire et ajouter 450 μL du milieu conditionné puits par puits.
- Laissez les neurones mûrir dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 à DIV 10.
3. Stimulation et absorption de Syt1
REMARQUE : Le protocole suivant applique l’absorption à 3 puits. Pour la dépolarisation de tout autre nombre de puits, ajustez les quantités en conséquence.
- Préparez 50 mL de tampon de dépolarisation 10x (640 mM de NaCl, 700 mM de KCl, 10 mM de chlorure de magnésium, MgCl2, 20 mM de chlorure de calcium, CaCl2, 300 mM de glucose, 200 mM d’HEPES, pH 7,4) dans un erlenmeyer.
REMARQUE : Le tampon de dépolarisation peut être maintenu à 4 °C pendant plusieurs semaines. Si une solution non dépolarisante est également utilisée, préparez une solution de Tyrode 10x composée de 1290 mM de NaCl, 50 mM de KCl, 10 mM de MgCl2, 20 mM de CaCl2, 300 mM de glucose, 200 mM de HEPES pH 7,4 afin de comparer le recyclage induit par stimulation avec le recyclage spontané. Après dilution à 1x, ajouter 1 μM de tétrodotoxine avant l’utilisation pour bloquer la génération de potentiel d’action.
- Dissoudre 1,87 g de NaCl, 2,61 g de KCl, 0,1 g de MgCl 2-6H 2O, 0,15 g de CaCl 2-2H2O et 3,0 g de glucose-1 H2O et 2,38 g de HEPES dans 50 mL d’eau distillée dans un erlenmeyer. Ajustez le pH avec du NaOH et filtrez la solution de manière stérile. Diluez le tampon 1:10 dans de l’eau distillée pour obtenir une concentration de 1x.
- Préparez du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (pH 7,4) pour la fixation après stimulation.
- Pour 500 ml de PFA à 4 % dans 1 PBS, dissoudre 20 g de paraformaldéhyde dans 450 ml de H2O.
REMARQUE : Le chauffage de la solution peut accélérer la dissolution, mais ne chauffez pas la solution à plus de 70 °C, car le PFA pourrait se désintégrer.
prudence: Le PFA est toxique, potentiellement cancérigène et tératogène. Portez des gants lorsque vous travaillez avec du PFA, passez sous la hotte et évitez l’ingestion.
- Laissez la solution refroidir jusqu’à RT et ajoutez 50 ml de solution mère 10x PBS. Ajustez le pH à 7,4 avec du NaOH/HCl (acide chlorhydrique) à l’aide d’un pH-mètre.
- Préchauffer 600 μL de 1x tampon de dépolarisation et 10 mL de milieu de culture cellulaire à 37 °C dans le bain-marie.
- Ajoutez 1 μL d’anticorps anti-Syt1 de souris (clone 604.2) dans le tampon de dépolarisation 1x et vortex pendant 10 secondes.
- Retirez et jetez le milieu de culture cellulaire des cellules. Ajouter 200 μL du mélange d’anticorps de dépolarisation dans chaque puits et incuber pendant 5 minutes à 37 °C et 5 % de CO2 dans l’incubateur.
- Retirez et jetez le mélange d’anticorps de dépolarisation et lavez-le trois fois avec un milieu de culture cellulaire. Ajouter 1 mL de milieu de culture cellulaire dans chaque puits et incuber pendant 30 secondes à RT. Retirer 750 μL de milieu et ajouter la même quantité de milieu frais. Répétez l’opération trois fois.
- Retirez et jetez le milieu de culture cellulaire et ajoutez 300 μL de PFA à 4 % dans 1x PBS. Incuber pendant 20 minutes à 4 °C.
- Lavez trois fois pendant 5 minutes chacune avec 1x PBS.
REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.
4. Immunocytochimie
- Préparez 50 mL de tampon de blocage.
REMARQUE : Le tampon de blocage peut être conservé à -20 °C pendant plusieurs mois.
- Dissoudre 2,5 g de saccharose et 1 g d’albumine sérique bovine (BSA) dans 5 mL de solution mère 10x PBS. Ajouter 1,5 mL de solution mère de détergent à 10 %. Remuez la solution jusqu’à ce que tous les composants soient correctement dissous et ajoutez du H2O distillé jusqu’à ce qu’il atteigne un volume final de 50 ml. Aliquote la solution et congelez les aliquotes pour le stockage.
- Diluer l’anticorps secondaire couplé à un fluorophore (dirigé contre l’espèce primaire de l’anticorps Syt1) dans 200 μL de tampon de blocage dans chaque puits à une dilution de 1:1000.
- Retirez et jetez le 1x PBS de chaque puits contenant une lamelle.
- Ajouter 200 μL de mélange tampon-anticorps bloquant dans chaque puits et incuber pendant 60 minutes à RT.
prudence: Comme les anticorps secondaires sont sensibles à la lumière, toutes les étapes doivent être effectuées dans l’obscurité.
- Après l’incubation, laver les cellules trois fois pendant 5 minutes avec 1 mL de 1x PBS.
- Incorporez les lamelles sur les lames de microscope avec le support d’enrobage.
- Ajoutez une goutte de 7 μL de milieu d’enrobage sur la lame de microscope. Retirez la lamelle de la plaque à 24 puits en la soulevant à l’aide d’une seringue et en la saisissant à l’aide d’une pince.
prudence: Les cellules à la surface de la lamelle sont facilement endommagées, de sorte que les pinces doivent être manipulées avec précaution.
- Trempez la lamelle dans de l’eau distillée pour retirer le PBS et séchez-la soigneusement en touchant un bord aux tissus mous.
- Retournez la lamelle sur la gouttelette du milieu d’enrobage, de sorte que la surface portant les cellules fasse face à la lame de microscope, intégrant ainsi les cellules dans le milieu d’enrobage.
- Laissez sécher les lames sous le capot pendant 1 à 2 h (couvrez-les pour éviter l’exposition à la lumière) et rangez-les dans une boîte à lames de microscope à 4 °C
REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.